登革熱病毒（DENV）是一種由蚊子傳播的黃病毒，是目前困擾*熱帶和亞熱帶國家的嚴重的蟲媒病毒。DENV在人類和伊蚊之間的維持它的生命周期，尤其是埃及伊蚊和白紋伊蚊。蚊子可能偶然以病毒宿主為食，獲取含有DENV顆粒的血液，這些病毒顆粒會被轉(zhuǎn)移到蚊子的中腸。病毒隨后感染蚊子腸上皮，然后傳播到其他組織，例如血淋巴和唾液腺，以致被感染的蚊子能夠通過血液將病毒傳播給其他宿主。蚊子在吸血過程中將病毒宿主的大量血液吸入腸道，這是蚊子感染DENV的主要方法。宿主血液在吸血幾天內(nèi)被蚊子機體消化和代謝的同時使得腸道上皮獲病毒感染。這表明血液成分或其代謝產(chǎn)物可以直接調(diào)節(jié)腸道上皮的免疫和生理狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)蚊子對病毒的易感性。

實際上，宿主血液中的許多因素都可能會調(diào)節(jié)病原體對蚊子的感染。例如，瘧原蟲通過脊椎動物宿主傳播到蚊子，其配子體在蚊子中腸內(nèi)進行有性生殖階段的發(fā)育成熟，而宿主血液中的許多因素在配子體的發(fā)育中起作用。蟲媒病毒對蚊蟲中腸的感染也受宿主血液成分的調(diào)節(jié)。宿主免疫應(yīng)答的變化，例如提高抗DENV包膜蛋白的免疫球蛋白滴度，可能會調(diào)節(jié)埃及伊蚊從蠕蟲病患者獲得DENV的能力。吸食血液時，人血中的低密度脂蛋白會被埃及伊蚊的腸上皮細胞吞噬并積聚在腸上皮中，從而阻礙了DENV感染埃及伊蚊。此外，通過血液消化產(chǎn)生氨基酸谷氨酸可激活涉及神經(jīng)遞質(zhì)GABA（γ-氨基丁酸）的信號，從而促進蚊子的免疫抑制，進而促進從吸食的血液中獲得病毒。除宿主血液成分外，黃病毒還可以利用其自身的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1），這些蛋白分泌到宿主血液中可有效地克服蚊子的腸道的不利環(huán)境，從而實現(xiàn)病毒的獲取。然而，宿主個體之間的血液成分可能會根據(jù)其遺傳，生理和營養(yǎng)狀況而有很大差異。

據(jù)此，清華大學醫(yī)學院，清華大學-北京大學生命科學聯(lián)合中心程功教授，提出血液成分的變化可能是調(diào)節(jié)蚊子對DENV敏感性并確定蚊子傳播的DENV能力的外在因素的這一假設(shè)。該研究團隊通過對人血清鐵在埃及伊蚊對DENV的吸收方面的影響、小鼠血清鐵水平及鐵缺乏癥小鼠中的補鐵在蚊子對DENV的獲取的影響等試驗，對這一假設(shè)進行驗證。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體外和體內(nèi)模型中，血清鐵的非血紅素結(jié)合形式在蚊子腸中正調(diào)控抗病毒ROS的產(chǎn)生。蚊子鐵代謝利用從人血中獲取的鐵來下調(diào)腸道上皮中抗氧化劑基因的表達，從而導致強大的ROS反應(yīng)。該項研究結(jié)果對蚊子吸食血液激活的ROS提供了一個機制上的見解。該研究成果已發(fā)表在Nature Microbiology期刊上，IF=14.174。博士后朱毅斌為一作者，程功教授為該文章的通訊作者。

題目：

Host serum iron modulates dengue virus acquisition by mosquitoes

期刊：Nature Microbiology

影響因子：14.174

PMID：31527795

一作者：

博士研究生朱毅斌

作者單位：清華大學醫(yī)學院

索萊寶合作產(chǎn)品：

吸血是蚊子感染蟲媒病毒的主要途徑。血液代謝物成分可以調(diào)節(jié)蚊子對蟲媒病毒的敏感性。該研究報告了人類血液中的血清鐵對蚊子獲取登革熱病毒的影響。埃及伊蚊對登革病毒的感染率與供者血清鐵濃度呈負相關(guān)。在小鼠-蚊子獲取模型中，補鐵可降低登革病毒感染率和病毒載量，而中和血清鐵可促進埃及伊蚊的登革病毒感染。值得注意的是，以缺鐵（鐵缺乏癥）小鼠為食的蚊子出現(xiàn)較高的登革熱病毒感染率。宿主缺鐵狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)在很大程度上減少了蚊子對登革熱病毒的獲得和感染。蚊子的鐵代謝途徑利用的是血清鐵而不是血紅素結(jié)合鐵，從而提高了腸道上皮中活性氧的活性，進而抑制登革熱病毒的感染。根據(jù)這些結(jié)果，人群中缺鐵的狀況可能有助于對登革熱病毒的矢量放縱，從而促進其通過蚊子傳播。

1、人血清鐵抑制埃及伊蚊對DENV的吸收

隨機收集了60份人類血液樣本，通過體外血液喂養(yǎng)系統(tǒng)向埃及伊蚊喂食含有人類血液和DENV-2感染的Vero細胞上清液的混合物對這一個假設(shè)進行研究。結(jié)果表明人類血液的質(zhì)量和成分可以調(diào)節(jié)蚊子對DENV的吸收。接下來檢測了供體血清樣本中的12種基本血液成分，并評估它們與蚊子中DENV含量的相關(guān)性。鐵濃度與埃及伊蚊的DENV-2感染呈負相關(guān)。通過用去鐵胺（DFX）（一種結(jié)合并從血清中去除鐵的化合物）來特異性中和人血樣品中的血清鐵，從而增加了埃及伊蚊的DENV感染率。口服檸檬酸鐵銨（FAC）（一種常用的鐵補鐵試劑）進行治療，體外喂養(yǎng)血液或DENV-2感染的Vero細胞對埃及伊蚊的感染率均降低。相反，口服DFX治療會增加埃及伊蚊的DENV患病率和病毒載量。

在生理條件下，血漿中循環(huán)的無機鐵主要與運鐵蛋白結(jié)合。該研究的人血清樣本中的轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度值均低于70％，這表明血樣是從具有穩(wěn)定的鐵的供體中采集的。該研究團隊預測這些血液樣本中會存在非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的無機鐵。因此，他們通過口服接種含鐵人轉(zhuǎn)鐵蛋白（全轉(zhuǎn)鐵蛋白），重新評估了血清鐵在蚊子的DENV感染中的作用。與FAC治療的結(jié)果一致，口服轉(zhuǎn)鐵蛋白的埃及伊蚊降低了DENV的患病率和病毒載量。

與血清中的鐵相反，紅細胞中的大多數(shù)鐵與血紅素結(jié)合。值得注意的是，埃及伊蚊的血紅素鐵濃度與DENV流行之間沒有顯著相關(guān)性。血清鐵和血紅素鐵是通過蚊子中不同的途徑被利用，從而導致不同的生理結(jié)果。他們評估了血紅素在蚊子中DENV感染的作用。與血紅素一起孵育對感染細胞中的病毒載量并沒有影響。接下來，他們研究了血紅素在DENV蚊子感染中的作用。蚊子直接暴露于血紅素中可導致DENV流行程度的輕度降低，這表明人血中的血紅素鐵可能在調(diào)節(jié)DENV對蚊子感染中沒有顯著作用。

2、小鼠血清鐵水平影響蚊蟲對DENV的獲取

接下來，他們利用小鼠-蚊子捕獲模型來評估血清鐵在蚊子捕獲DENV中的作用。AG6小鼠（一種缺乏I型和II型干擾素受體（ifnagr-/-）的C57BL / 6小鼠）已被用作DENV感染的動物模型。在這里，AG6小鼠皮下感染DENV。接種病毒兩天后，感染的小鼠受到埃及伊蚊叮咬15分鐘。然后立即給小鼠靜脈內(nèi)注射全鐵轉(zhuǎn)運蛋白作為鐵的補充劑。留置15分鐘使鐵在血液中擴散，然后將經(jīng)過治療的小鼠再次被蚊子叮咬。兩個連續(xù)叮咬之間的時間短暫，可避免蚊子在吸食血液中獲取病毒顆粒數(shù)量的變化。全轉(zhuǎn)鐵蛋白接種后，小鼠血清中的鐵濃度顯著增加，而病毒在此短時間內(nèi)沒有變化。在全轉(zhuǎn)運鐵蛋白治療的小鼠中，埃及伊蚊的DENV感染率和病毒載量大大降低。

接下來，他們評估了小鼠循環(huán)中血清鐵的消耗是否會改變DENV的獲取。靜脈內(nèi)接種DFX可以從受感染小鼠的血清中去除鐵，而這種治療并不能改變小鼠的DENV病毒血癥。以DFX處理和感染的小鼠為食的蚊子中DENV的患病率比以模擬治療感染小鼠為食的蚊子高得多，這表明血清鐵不會影響宿主體內(nèi)DENV病毒血癥的水平，但會通過吸食血液影響蚊子獲得DENV。

3、蚊子的鐵代謝途徑通過活化腸道上皮中活性氧的活性抑制了DENV的感染

蚊子吸收鐵的兩個主要來源是血清和紅細胞中的血紅素。食物中的血清鐵與蚊子中的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合并被運輸?shù)轿米蛹毎小４送?，血清鐵可以通過二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1（DMT1）或其他未知轉(zhuǎn)運蛋白導入昆蟲腸道上皮。除血清無機鐵外，溶血也導致細胞外血紅素和血紅蛋白的存在。人血漿中的血紅素可能通過稱為血紅素載體蛋白1（HCP1）的轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到細胞中。血紅素也可以與血紅蛋白形成復合物，然后轉(zhuǎn)運到細胞中。血清中的血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白相互作用，用于下游鐵代謝。隨后，血紅蛋白和血紅蛋白血紅素加氧酶1（HO1）在細胞內(nèi)進行處理，釋放出無機鐵以進行循環(huán)利用。通過這些途徑從血液中獲取的鐵可能被存儲在蚊子細胞的鐵蛋白中。在埃及伊蚊中，DMT1、血凝蛋白或結(jié)合珠蛋白的人類基因沒有同源性；然而，在埃及伊蚊中已鑒定出人類轉(zhuǎn)鐵蛋白（AaTransferrin），鐵蛋白（AaFerritin）、HCP1（AaHCP1）和HO1（AaHO1）基因的同源基因。接下來，他們研究了鐵蛋白在DENV感染中的作用。沉默埃及伊蚊鐵蛋白H（AaFerritin H）基因可減少DENV復制；而伊蚊鐵蛋白H（AaFerritin H）的異位表達會增加Aag2細胞中的病毒載量。敲除伊蚊鐵蛋白H（AaFerritin H）基因可降低DENV對埃及伊蚊的感染。

接下來，他們評估了這些蚊子轉(zhuǎn)鐵蛋白在DENV獲取中的作用。在埃及伊蚊基因組中鑒定到四個鐵轉(zhuǎn)蛋白（AaTransferrin）基因。沉默單個鐵轉(zhuǎn)蛋白基因（AaTransferrins）可適度增強蚊子的DENV感染；同時敲除這四個基因?qū)е掳＜耙廖弥懈叩腄ENV感染率和病毒載量，表明這些鐵轉(zhuǎn)蛋白基因（AaTransferrins）在蚊子鐵代謝中具有協(xié)同作用。他們接下來在果蠅表達系統(tǒng)中表達和純化鐵轉(zhuǎn)蛋白基因（AaTransferrin）?？诜@種轉(zhuǎn)鐵蛋白可以減少蚊子的DENV載量。

血紅素中的鐵或許可以被運輸?shù)轿米蛹毎?，然后由血紅素加氧酶釋放，以通過蚊子的鐵代謝進行再循環(huán)。因此，他們推測血液降解產(chǎn)生的血紅素可能被HCP1轉(zhuǎn)運到蚊子細胞中，而鐵可能被HO1在到細胞內(nèi)循環(huán)利用。但是，沉默AaHCP1或AaHO1基因不會影響埃及伊蚊中DENV感染和的活性氧（ROS）的積累。血紅素代謝系統(tǒng)在蚊子體內(nèi)的功效很低，表明血紅素鐵可能在調(diào)節(jié)DENV感染中沒有重要作用。

接下來，他們研究了血清鐵抑制蚊子獲得DENV的機制。解剖經(jīng)FAC處理或未經(jīng)FAC處理的人血喂養(yǎng)的蚊子中腸，進行RNA測序（RNA-seq）分析。選擇免疫信號成分，酶和效應(yīng)物進行分析。

在用FAC處理的人血喂食蚊子后，29個基因的表達水平在24h時改變了4倍以上，51個基因在48h時改變了4倍以上。經(jīng)FAC處理的血液喂養(yǎng)的蚊子中腸和對照組蚊子的中腸的RNA干擾，Toll，免疫缺陷和Janus激酶信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活劑（JAK-STAT）信號傳導途徑以及編碼抗菌肽（AMPs）的基因水平均沒有顯著差異。然而，根據(jù)RNA-seq分析的結(jié)果，在埃及伊蚊的腸上皮中，多種埃及伊蚊過氧化氫酶（AaHPX）和超氧化物歧化酶（AaSOD）基因的表達被全面下調(diào)了4-13,000倍。用定量PCR方法驗證了這些基因在喂血48h后的變化。實際上，HPX和SOD都作為調(diào)節(jié)因子，通過去除由產(chǎn)生ROS的酶和代謝活性合成的過量ROS來阻止ROS活性。ROS的激活是限制蚊子中DENV感染的關(guān)鍵。因此，他們推測從人血清中獲得的鐵可能會降低這些H2O2分解酶的表達，從而增加ROS的活化。剔除這些基因會嚴重影響DENV對埃及伊蚊的感染。沉默AaHPXs和AaSODs可以增加ROS的活性。此外，通過口服FAC補充可提高埃及伊蚊腸道中ROS的活性，而對AaFerritin H基因的抑制可以增強蚊子上皮細胞的ROS反應(yīng)。FAC介導的補鐵通過ROS激活提高了蚊子對DENV感染的抵抗力，而用乙酰半胱氨酸抑制ROS活性可恢復FAC處理過的蚊子的DENV載量和ROS活性。他們評估了口服人體單個血液樣本的蚊子中腸的ROS反應(yīng)。人血清中的鐵濃度與腸道上皮中的ROS活性呈正相關(guān)，表明血清鐵通過誘導蚊子腸上皮中的ROS活性而阻礙DENV復制。

4、鐵缺乏癥小鼠中的補鐵降低了蚊子對DENV的獲取

鐵缺乏癥是登革熱流行國家常見的公共衛(wèi)生問題。因此，他們評估了鐵缺乏狀態(tài)是否可以調(diào)節(jié)蚊子中DENV的發(fā)病率。先，他們建立了長期缺鐵AG6小鼠模型。用無鐵飲食喂養(yǎng)AG6小鼠五周。正常飲食的小鼠充當模擬對照。食用無鐵飲食后，糞便和血清中的鐵濃度逐漸降低。接下來，他們用DENV-2皮下感染AG6小鼠。DENV-2感染后第1天第5天，感染的小鼠每天受到蚊子叮咬（云南瑞麗毒株）。與以正常飲食喂養(yǎng)的小鼠相比，無鐵飲食不會影響DENV病毒血癥。以鐵缺乏小鼠為食，可提高埃及伊蚊的DENV患病率和病毒載量。接下來，他們又利用Aegypti Mengla毒株（另一個田間蚊子群）進一步研究宿主鐵在調(diào)節(jié)蚊子中DENV感染中的作用。小鼠的無鐵飲食對DENV病毒血癥沒有顯著影響。小鼠鐵缺乏的狀況促進了埃及伊蚊通過吸食血液獲得DENV。

接下來，他們研究了缺鐵小鼠中補鐵是否可以通過田間蚊蟲來調(diào)節(jié)DENV的獲取。他們通過腳墊將DENV-2皮下注射感染了缺鐵的AG6小鼠。每天向感染的鐵減少癥小鼠靜脈內(nèi)注射FAC或PBS，然后使其受到蚊子叮咬。補鐵可增加小鼠血清中的鐵濃度。小鼠病毒血癥不受FAC處理的調(diào)節(jié)。鐵缺乏癥小鼠血清鐵濃度的升高降低了蚊中腸和唾液腺的DENV患病率。他們將埃及伊蚊門格拉株與鐵缺乏癥小鼠用于隨后的研究。小鼠血清鐵濃度的增加會降埃及伊蚊門格拉株的DENV患病率和全身及唾液中的病毒載量。

他們評估了補鐵對蚊子在低鐵人類血液樣本中對DENV獲取的調(diào)節(jié)機制。人血清中的正常鐵濃度范圍從大約0.5到2.5μgml^-1。選擇了十八份血清鐵濃度低于0.55μgml^-1的血液樣本進行研究。血清中的鐵濃度分別增1.5μgml^-1和μgml^-1。血清鐵濃度的升高以濃度依賴性的方式降低了蚊子的DENV患病率。血清鐵濃度增加2.5μgml^-1*消除了以五個血樣為食的蚊子對DENV的獲取，這表明宿主體內(nèi)鐵缺乏癥的改善可能會降低蚊子對DENV的傳播。

本研究團隊通過一系列試驗篩選，發(fā)現(xiàn)宿主血清中鐵離子含量與蚊蟲吸血獲取病毒的能力呈高度負相關(guān)關(guān)系，證明宿主血清鐵離子濃度是阻抑蚊蟲獲取病毒感染的關(guān)鍵負調(diào)控因素。進一步研究結(jié)果顯示，血清中鐵離子進入蚊蟲腸道后，可被腸道細胞的鐵代謝系統(tǒng)直接利用，抑制細胞內(nèi)的抗氧化酶基因表達，導致蚊蟲腸道中活性氧(ROS) 水平大幅提高，終阻抑病毒在蚊蟲體內(nèi)的感染擴增。該研究結(jié)果揭示向登革病毒疫區(qū)的人群中普遍補鐵是切斷登革病毒在自然界中傳播的一種有效手段，補鐵將為登革病毒防治提供全新的防控思路和策略。

備注

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