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      文獻解讀|分層組裝的DNA線框納米結(jié)構(gòu),可用于癌癥高效成像和靶向治療
        疏水小分子化療藥物的系統(tǒng)分布和非靶向細胞毒性導(dǎo)致副作用和療效降低,阻礙了其在癌癥治療中的廣泛應(yīng)用。由于包括有機聚合物、無機納米顆粒、脂質(zhì)體等藥物載體的快速發(fā)展,許多靶向給藥策略已經(jīng)建立起來,以克服這些缺點。然而,這些合成材料的生物相容性低,降解性差和具有一定的免疫原性風(fēng)險。大多數(shù)納米藥物載體,尤其是聚合物體系,總體分子量和大小難以控制,導(dǎo)致藥物與載體的比例不均,重現(xiàn)性低。靶向給藥的這些內(nèi)在問題阻礙了其在醫(yī)學(xué)和臨床試驗中的廣泛應(yīng)用

      由于DNA納米結(jié)構(gòu)的尺寸和幾何形狀易于預(yù)先設(shè)計和構(gòu)建,它們在生物傳感、生物成像、藥物控制釋放和智能納米醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。為了提高與靶細胞的接觸機會,三維DNA納米結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更好的可調(diào)性和結(jié)合能力。DNA折紙被認為是DNA結(jié)構(gòu)納米技術(shù)的重大突破,因為它可以輕松控制大小、形狀和3D幾何形狀。許多DNA折紙結(jié)構(gòu)已經(jīng)被開發(fā)用于多重有效載荷和刺激反應(yīng)藥物釋放。然而,內(nèi)源性核酸酶降解的不穩(wěn)定性和數(shù)百個未使用的短鏈的高成本阻礙了DNA折紙轉(zhuǎn)化為臨床試驗。DNA多面體納米結(jié)構(gòu)具有良好的可編程性、的尋址性和明確的空間定向性,為分子醫(yī)學(xué)作為藥物載體在理想位置功能化藥物提供了一個有前景的平臺。

      DNA四面體和其他多面體骨架因其易于自組裝、高度耐核酸酶穩(wěn)定性和良好的內(nèi)化作用而被廣泛報道。通過利用這些因子,各種小分子藥物、反義寡核苷酸和siRNA被這些多面體納米結(jié)構(gòu)裝載,以增強細胞攝取、治療效果和生物安全性。基于有限的可編程性和載藥能力不足的典型的DNA四面體(由四個ssDNA組成),譚蔚泓院士及其團隊在本文中報道了一個創(chuàng)新的納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計和應(yīng)用:由DNA八面體線框和CA4(廣譜微管抑制劑)功能化的Sgc8c寡核苷酸適配子(CA4-FS)組成。多個CA4分子可以整合在一個核酸適配體功能化的八面體DNA納米載體中,為靶向癌癥治療提供了良好的CA4傳遞,可用于的癌癥成像和有效的靶向治療


       

      基本信息

      題目:

      Hierarchical Fabrication of DNA Wireframe Nanoarchitectures for Efficient Cancer Imaging and Targeted Therapy

      期刊:ACS Nano

      影響因子:14.588

      通訊作者:譚蔚泓,柯勇剛和王雪強為共同通訊作者

      作者單位:湖南大學(xué)和美國埃默里大學(xué)

      索萊寶合作產(chǎn)品:

      產(chǎn)品名稱

      產(chǎn)品貨號

      ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒

      CA1020


      摘 要

      雖然小分子藥物在癌癥治療中起著至關(guān)重要的作用,但小分子藥物的固有問題,如溶解性差和系統(tǒng)性毒性,大大降低了它們的抗癌功能,并造成了副作用。為了達到令人滿意的治療效果,必須開發(fā)創(chuàng)新的靶向系統(tǒng),以保證抗癌藥物、高效地遞送。在本研究中,作者采用分層自組裝策略來制備由DNA八面體線框和化學(xué)藥物功能化的Sgc8c適配體組成的核-殼納米結(jié)構(gòu)。DNA納米結(jié)構(gòu)的高滲透長滯留效應(yīng)和Sgc8c適配體的主動靶向能力,使得高選擇性化療藥物遞送和體內(nèi)高效成像和治療成為可能。作者的多功能納米結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢進一步體現(xiàn)在其血清穩(wěn)定性、優(yōu)異的積累能力、深穿透能力、顯著提高的治療效果和良好的生物安全性。這項研究顯示了這種核-殼DNA納米結(jié)構(gòu)在藥物裝載控制、藥物傳遞和個性化用藥方面的潛力。

      研究內(nèi)容及結(jié)果

      1.DNA八面體線框的分層自組裝

      作者首先獲得了單鏈CA4-FS,接下來通過分層自組裝策略構(gòu)建了一個DNA八面體。采用可編程退火的方法,構(gòu)建了6個四通連接DNA塊作為DNA八面體的頂點。然后DNA塊通過它們的單鏈結(jié)構(gòu)域連接在一起,形成一個DNA八面體線框。優(yōu)化了構(gòu)建條件后,驗證了由DNA塊逐步組裝的DNA八面體(圖1a)。AFM成像證實了八面體的形態(tài)(圖1b)。為了證明藥物負載的可調(diào)性,作者構(gòu)建了具有不同手柄數(shù)的DNA八面體用于與CA4-FS雜交。

      圖1

      這種DNA八面體的可尋址性和可預(yù)見性允許地裝載不同數(shù)量的單鏈CA4-FS。作為概念驗證,作者構(gòu)建了半負載CA4-八面體(hCA4-Oct)和全負載CA4-Oct,并測定了負載效率(圖1c)。為了進一步驗證hCA4-Oct和CA4-Oct的可編程組裝,作者接下來分別用Cy3標記的Oct-12H、Cy3標記的Oct-24H和Cy5標記的CA4-FS研究了CA4-Oct的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)。正如預(yù)期的那樣,hCA4-Oct和CA4-Oct均顯示出明顯的FRET信號。八面體水動力尺寸為17.0±1.1nm,功能Oct-12H和Oct-24H的水動力尺寸分別為24.9±3.0和26.5±3.4nm。hCA4-Oct的大小為29.5±3.2nm,CA4-Oct的大小為30.1±3.7nm(圖1d)。AFM成像也證實了hCA4-Oct和CA4-Oct的形成。這一結(jié)果表明CA4-FS指向DNA八面體核的外側(cè),形成三層核-殼納米組裝體。上述結(jié)果證明了在DNA八面體上可以地裝載多個游離藥物分子。

      2.細胞內(nèi)化與腫瘤球體穿透

      為了大限度地負載CA4-FS,接下來的研究選擇了一個*負載CA4修飾的DNA八面體。圖2a,b結(jié)果證明了通過修飾DNA納米結(jié)構(gòu)上的適配體增強了細胞內(nèi)化。競爭性阻斷實驗也支持了這一結(jié)論。CA4-Oct的位移大于CA4-FS。基于上述結(jié)果,作者推斷,內(nèi)化增強的因素有:(i)識別單元增加(24 CA4-FS vs 1 CA4-FS);(ii)八面體結(jié)構(gòu)的剛度;(iii)提高CA4-Oct的穩(wěn)定性。對于穩(wěn)定性因子的重要作用,作者測試了CA4-Oct和CA4-FS在10%胎牛血清中的生物穩(wěn)定性。8小時處理后,CA4-Oct保持不變,但55%的CA4-FS被降解。所以CA4-Oct的內(nèi)化速率比CA4-FS的內(nèi)化速率要快(圖2b)。CA4-Oct和CA4-FS在無FBS培養(yǎng)基中保持了相同的完整性,表現(xiàn)出了相同的時間依賴性內(nèi)化速率,進一步說明了至關(guān)重要的穩(wěn)定因子減緩了CA4-FS的時間依賴性內(nèi)化。

      為了研究細胞選擇性,作者還檢測了PTK7陰性的NCM460細胞(正常結(jié)直腸細胞系)。與NCM460細胞相比,CA4-Oct和CA4-FS對HCT116細胞的吸收更多(圖2c)。值得注意的是,與單鏈CA4-FS相比,CA4-Oct對HCT116細胞和NCM460細胞間CA4傳遞的細胞內(nèi)化選擇性要大得多(圖2d)??梢暬簿劢钩上褚沧C實了上述發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明CA4-Oct比單鏈CA4-FS具有更多的細胞內(nèi)化和選擇性。為研究CA4在實體腫瘤組織中的遞送深度,制備HCT116三維多細胞腫瘤球形體。與單鏈CA4-FS相比,CA4-Oct在腫瘤球狀體中心有更高的強度(圖2e)。這些發(fā)現(xiàn)支持了適配體殼由于其識別和結(jié)合作用而起主導(dǎo)作用的假說,以及DNA八面體核促進CA4-FS在腫瘤組織中的插入。


      圖2

      3.靶向性細胞毒性和穩(wěn)定性

      在鑒定了CA4-Oct的細胞內(nèi)化和穿透能力后,作者測定了其對目標癌細胞的細胞毒性。為了研究適配體介導(dǎo)的靶向給藥的影響,作者選擇了8h的短期孵育和40h的額外孵育,將抗癌功能從非特異性細胞吸附和核溶解中分離出來。作者發(fā)現(xiàn),對照組Sgc8c、Lib、CA4-Lib、DNA八面體和CA4-Lib-Oct對HCT116細胞沒有或可忽略的細胞毒性(圖3a)。正如預(yù)期的那樣,CA4-Oct比CA4-FS對HCT116細胞表現(xiàn)出更高的抑制細胞毒性。為了進一步強調(diào)CA4-Oct的細胞特異性毒性,作者還比較了對HCT116和NCM460細胞的毒性。如圖3a所示,在孵育48小時后(預(yù)處理8小時后洗),除CA4外,所有組對NCM460細胞都沒有表現(xiàn)出或可以忽略不計的細胞毒性?;谶@些結(jié)果,CA4-Oct通過包裹CA4-FS表現(xiàn)出對腫瘤細胞的選擇性,從而表現(xiàn)出選擇性細胞毒性。

      接下來,作者將培養(yǎng)時間增加到48小時,以評估DNA序列潛在的不穩(wěn)定性介導(dǎo)的降解所導(dǎo)致的脫靶風(fēng)險的可能性?;趫D3a研究結(jié)果,作者認為顯著提高CA4-Oct的核酸酶抗性可以顯著緩解單價CA4-FS的脫靶效應(yīng),從而獲得更好的安全性。

      為了進一步系統(tǒng)地揭示CA4-Oct的靶向細胞毒性,作者構(gòu)建了細胞共培養(yǎng)系統(tǒng),模擬藥物對體內(nèi)多細胞共存環(huán)境的現(xiàn)實影響。在本研究中分別用CA4-Oct或CA4-FS處理轉(zhuǎn)染了GFP的HCT116(GFP陽性)和NCM460(GFP陰性)的共培養(yǎng)體系(1:1,Q3/Q4,圖3b)。在未經(jīng)任何處理的孵育4h后,由于癌細胞的惡性增殖,活癌細胞與正常活細胞的比率(RCN)約為2:1(圖3c)。短期治療(8h沖洗后),CA4-Oct組RCN變?yōu)?:4,CA4-FS組RCN僅為1:2(圖3d,e)。除抑制增殖外,CA4-Oct殺死約60%的HCT116細胞,而CA4-FS僅殺死45%((Q2/(Q2+Q3),圖3d,e)。同時,CA4-FS和CA4-Oct導(dǎo)致正常細胞凋亡率較低(Q1/(Q1+Q4),圖3d,e)。在長期治療(不洗滌)中,CA4-FS殺死了52%的NCM460細胞,盡管它誘導(dǎo)了71%的HCT116細胞凋亡(圖3g)。然而,CA4-Oct也能殺死71%的HCT116細胞,但僅能引起28%的NCM460細胞凋亡(圖3f)。因此,CA4-FS和CA4-Oct的RCNs分別約為1:3和1:5。顯然,由于細胞外血清穩(wěn)定性的差異,CA4-FS的脫靶不良反應(yīng)比CA4-Oct嚴重的多。這些結(jié)果表明,DNA八面體增強了腫瘤細胞的靶向細胞毒性,降低了正常細胞的不穩(wěn)定性介導(dǎo)的脫靶風(fēng)險。

      圖3

      4.活體成像分析

      在良好的體外表現(xiàn)的鼓舞下,作者實施了體內(nèi)評估。首先,將Cy5標記的CA4-Oct、Cy5標記的CA4-FS和游離的Cy5分別靜脈注射到SD大鼠,通過追蹤眼眶靜脈血熒光信號來評價它們的藥代動力學(xué)。補充實驗結(jié)果支持Cy5在體內(nèi)實驗中未出現(xiàn)超出說明以外的實驗現(xiàn)象,攜帶CA4的CA4-Oct比單鏈CA4-FS的血液濃度和循環(huán)時間要高得多。

      CA4-FS組在注射后4和8小時腫瘤部位顯示出更亮的Cy5信號,但在注射后12小時顯示出非常微弱的熒光信號(圖4a)。但CA4-Oct組在注射后第1天熒光信號仍然很亮。同時處死小鼠進行離體分析,評價其生物分布。靜脈給藥后12h,Cy5和CA4-FS主要分布在腎臟,而CA4-Oct在腫瘤部位表現(xiàn)出超過24h的強烈熒光信號(圖4b)。

      為了進一步確定CA4-Oct在實體瘤組織中是否具有*的聚集能力和穿透能力,作者收集CA4-Oct組和CA4-FS組的腫瘤組織進行切片分析。CA4-Oct組在各實驗時間點的Cy5信號均比CA4-FS組更亮(圖4c,d),說明CA4-Oct具有更強的聚集能力,能夠?qū)⒏嗟腃A4藥物傳遞到腫瘤組織。從CA4-FS與FITC標記的血管生物標志物CD31共定位結(jié)果來看,CA4-FS大多數(shù)分布在腫瘤血管內(nèi)部或周圍(圖4d)。相比之下,大多數(shù)CA4-Oct穿過腫瘤血管,到達腫瘤組織(圖4c),這將有利于深部給藥。多價、致密、剛性的CA4-Oct確實增強了單鏈CA4-FS的穿透能力及其在實體腫瘤組織中的治療潛力。

      圖4

      5.體內(nèi)靶向癌癥治療

      圖像表征完成后,作者在HCT116荷瘤異種移植小鼠中進行了抗腫瘤實驗,未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象。經(jīng)5次靜脈給藥(接種腫瘤后第18天),CA4-Oct、CA4-FS、CA4組的腫瘤生長抑制率分別達到86%、65%、46%(圖5a)。但一旦停止給藥,CA4-Oct的抑瘤率仍維持在85%左右,而CA4-FS組和CA4組的抑瘤率進一步下降,分別降至54%和30%(第32天)。這可能是由于CA4-Oct滲透深度較深,滯留時間較長所致。此外,體外腫瘤重量和腫瘤圖像均表明CA4-Oct是作為靶向藥物的選擇(圖5b,c)。為了評估治療的安全性,作者首先監(jiān)測了這些小鼠的體重變化。由于全身分布的副作用,CA4處理的小鼠體重明顯減輕(約7%)(圖5d)。與CA4-Oct組相比,CA4-FS組體重增長也下降了6%。第32天取臟器稱重,評價藥物對健康組織的可能損傷。與PBS組和CA4-Oct組相比,CA4和CA4-FS組肝臟異常增重更為嚴重(圖5e)。對這個解毒器官的損害可能是歸因于CA4-FS的脫靶毒性和CA4的非選擇性毒性。為了進一步闡明CA4-Oct治療的有效性和安全性,作者采集腫瘤組織、主要臟器和血液進行更詳細的研究。CA4-Oct顯示TUNEL陽性細胞(TUNEL+)有約65%的凋亡,而CA4-FS和CA4僅顯示35%和20%的殺傷能力(圖5f)。與CA4-FS組和CA4組相比,增殖標記Ki67信號顯示CA4-Oct對腫瘤增殖的抑制作用(圖5g)。

      接下來作者也采集了相同條件下未接種腫瘤的正常小鼠的正常器官和血液。首先,作者研究了可能的肝毒性,因為CA4可以引起肝痛。與未接種腫瘤的正常組相比,PBS組肝內(nèi)淋巴細胞輕微浸潤,但給藥CA4-Oct減輕了這種趨勢(圖5h)。PBS和CA4-Oct均未顯示明顯的肝細胞死亡。CA4-FS組肝細胞局部壞死,肝星狀細胞增生。在小鼠肝臟中央靜脈周圍觀察到局部淋巴細胞浸潤(圖5h)。更嚴重的是CA4給藥后肝細胞大面積斑片狀壞死,HSCs增生更為明顯。CA4組可見許多中性粒細胞和淋巴細胞浸潤區(qū),丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶異常升高也證實了這一趨勢。這些結(jié)果顯示CA4-FS和CA4的肝毒性水平不同,而CA4-Oct顯示出一定的潛在安全性。

      圖5

      然后作者評估各組腎臟的HE染色切片的組織病理學(xué)。與正常組比較,PBS組與CA4-Oct無明顯差異(圖5i)。然而,CA4-FS給藥后,可以看到腎小管刷狀緣局灶性脫落和輕微的細胞腫脹。在游離CA4組中,除了明顯的細胞脫落和腫脹外,還發(fā)現(xiàn)血清肌酐明顯升高,間質(zhì)水腫伴炎性細胞浸潤(圖5i)。這些結(jié)果表明,適配體修飾緩解了CA4的腎臟損傷,而DNA八面體保護CA4-FS免于靶CA4外溢至腎臟組織。

      作者繼續(xù)檢查其他的生化和血液學(xué)數(shù)據(jù)。與正常組和PBS組比較,CA4-Oct組CK無明顯升高,而CA4-FS組和CA4組CK有不同程度升高。說明CA4-FS和CA4可造成不同程度的心臟損傷。也有報道稱游離CA4可引起血小板減少癥。CA4確實導(dǎo)致血小板明顯減少,但CA4-FS和CA4-Oct組未見損傷。另一個不一致的指標是白細胞(WBCs)的數(shù)量。令人驚訝的是,與正常組相比,CA4-Oct組的WBCs沒有明顯升高,而PBS、CA4-FS和CA4組的WBCs明顯升高。這些發(fā)現(xiàn)進一步說明PBS、CA4-FS和CA4可能導(dǎo)致潛在的炎癥和骨髓抑制。只有CA4-Oct的抗癌方案可以獲得效的治療,且具有足夠的生物安全性。不幸的是,作者并沒有從心臟、肝臟和脾臟的HE切片評估中發(fā)現(xiàn)CA4-Oct的其他優(yōu)勢。此外,除CA4外,其他各組均未誘導(dǎo)免疫反應(yīng)指標明顯升高。

      結(jié) 論

      為了解決小分子藥物治療癌癥的問題,作者設(shè)計了一種創(chuàng)新的DNA線框納米結(jié)構(gòu),它由DNA八面體和CA4-FS組成。本研究利用固相合成技術(shù)制備CA4-FS,并利用DNA分層自組裝技術(shù)構(gòu)建具有外向手柄數(shù)可控的DNA八面體。通過編程加載過程,多個CA4-FS可以準確地附著在DNA八面體上,形成一個三維核-殼納米結(jié)構(gòu)。DNA八面體納米載體結(jié)構(gòu)緊湊、剛性強,與5’端和3’端暴露的靈活適配體載體相比,具有更高的耐核酶穩(wěn)定性。由于DNA手柄的功能化,該DNA納米結(jié)構(gòu)顯示出和高容量的藥物裝載控制性能。同時,DNA線框納米載體重塑了單鏈CA4-FS的性質(zhì),具有更好的生物穩(wěn)定性、更高的細胞內(nèi)化、優(yōu)異的成像特性和更深的穿透腫瘤深度,從而獲得更有效的腫瘤成像和靶向治療。綜上所述,這種基于分層自組裝的具有藥物定位功能的八面體DNA為腫瘤靶向治療和醫(yī)學(xué)提供了一個有效和有前景的平臺。

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      優(yōu)級胎牛血清(無噬菌體低內(nèi)毒素)

      11011-8611

      RPMI Medium 1640(含雙抗)

      31800

      4%組織細胞固定液

      P1110

      高效RIPA裂解液(組織/細胞)

      R0010

      Hoechst 33342/PI雙染試劑盒

      CA1120

      Anti-MKI67 Polyclonal Antibody

      K007523P

      Anti-MKI67 Polyclonal Antibody

      K002224P

      DAPI溶液(即用型)

      C0065

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