在免疫抑制的TME中,高水平的乳酸通過促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)表型向M2型極化和抑制CD8+T細(xì)胞活性來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。因此,腫瘤源性乳酸作為免疫抑制TME的免疫調(diào)節(jié)因子,是未來有潛力的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。作為一種單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCT),沉默MCT-4的表達(dá)可以增加細(xì)胞內(nèi)乳酸含量來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,并降低細(xì)胞外乳酸含量來調(diào)節(jié)TME。聯(lián)合化療和抑制乳酸外排可能具有良好的體內(nèi)抗腫瘤療效。
響應(yīng)谷胱甘肽(GSH)的生物可降解介孔有機(jī)硅納米顆粒(MONs)是抗癌藥物傳遞的候選材料之一,通常采用二硫鍵(−S-S-)作為中間連接劑來制備硅網(wǎng)絡(luò)?;谇叭搜芯匡@示的中空MONs(HMONs)巨大的應(yīng)用潛力,作者尋求將可生物降解的HMONs作為一種多用途的納米給藥平臺(tái),用于協(xié)調(diào)化療和免疫治療,以獲得更大的治療效益。
重慶大學(xué)蔡開勇教授和西南大學(xué)羅忠教授團(tuán)隊(duì)提出了通過抑制乳酸外流和化療的聯(lián)合作用,消除免疫抑制性TME,將免疫抑制性腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”性腫瘤,并取得佳抗腫瘤療效的有效策略。通過在血液循環(huán)、腫瘤攝取和細(xì)胞內(nèi)釋放的順序遞送階段調(diào)控激活,納米平臺(tái)可以提供平衡的安全性和治療性能。此外,納米平臺(tái)可以誘導(dǎo)免疫促進(jìn)因子的表達(dá),并激活免疫應(yīng)答來抑制肺轉(zhuǎn)移。
基本信息
題目:
Engineering of Cascade-Responsive Nanoplatform to Inhibit Lactate Efflux for
Enhanced Tumor Chemo-Immunotherapy
期刊:ACS NANO
影響因子:14.588
PMID:32975406
通訊作者:蔡開勇教授和羅忠教授為共同通訊作者
作者單位:重慶大學(xué)和西南大學(xué)
索萊寶合作產(chǎn)品:
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒 | CA1020 |
摘 要
乳酸作為腫瘤中高速有氧糖酵解的增加產(chǎn)物,可以調(diào)節(jié)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境(TME)。將羥基喜樹堿(HCPT)和siMCT-4負(fù)載于經(jīng)PEG-CDM表面修飾的、GSH響應(yīng)型中空介孔有機(jī)二氧化硅納米平臺(tái),用于協(xié)同腫瘤化療免疫治療。此納米平臺(tái)對(duì)腫瘤細(xì)胞弱酸性TME和高水平GSH有級(jí)聯(lián)反應(yīng)。HCPT和siMCT-4從納米平臺(tái)持續(xù)釋放,用于化療和抑制細(xì)胞內(nèi)乳酸外流。細(xì)胞內(nèi)乳酸和HCPT升高可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞外乳酸的降低使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMS)的表型由M2型轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型,并恢復(fù)了體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的活性。結(jié)果表明,納米平臺(tái)通過抑制乳酸外流與化療聯(lián)合作用,有效地清除了免疫抑制TME,抑制了腫瘤生長,且抑制了B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。這是一種將免疫抑制腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”瘤,并在體內(nèi)高效抑制腫瘤生長的策略。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.響應(yīng)GSH降解的納米顆粒的合成與表征
首先在前人研究的基礎(chǔ)上合成了固體二氧化硅納米顆粒(記為sSiO2 NPs)。之后,以sSiO2 NPs為基礎(chǔ)合成了中空介孔有機(jī)硅納米顆粒(命名為HMONs)。BSA用于阻斷裝載在HMONs中的HCPT(HMONs@HCPT-COOH),以降低納米顆粒對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)表明,BSA能穩(wěn)定地在HMONs表面組裝。
為了有效的加載siMCT-4,PEI被裝載到HMONs@HCPT-BSA-COOH的表面。后,將PEG-CDM引入HMONs@HCPT-BSA-PEI表面,延長血液循環(huán)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明成功合成了GSH降解中空介孔有機(jī)硅納米膠囊和PEG化PEI功能化BSA封阻的HMONs(HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG)。
圖1
2. 響應(yīng)GSH的藥物釋放和納米顆粒吞噬
由于實(shí)體瘤的這種異常代謝,腫瘤細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累高劑量的還原性谷胱甘肽?;趯?shí)體腫瘤的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了一個(gè)納米藥物和siRNA傳遞系統(tǒng),其具有弱酸性和GSH響應(yīng)性(HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4)。HCPT釋放結(jié)果表明(圖2A),納米平臺(tái)具有良好的GSH響應(yīng)能力。采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)(圖2B)和激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)(圖2C,D)對(duì)納米顆粒的吞噬作用進(jìn)行表征。由于CDM鍵的斷裂,暴露PEI可以增強(qiáng)B16F10的細(xì)胞攝取功效。PEG-CDM組對(duì)腫瘤微環(huán)境的弱酸反應(yīng)并暴露PEI組。B16F10細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)正電荷促進(jìn)吞噬作用,這與其他研究一致。在腫瘤細(xì)胞中,納米藥物和siRNA傳遞系統(tǒng)持續(xù)釋放化療藥物HCPT和siMCT-4,用于協(xié)同腫瘤化療免疫治療。
通過瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)驗(yàn)證納米顆粒負(fù)載siRNA的效果。結(jié)果表明,當(dāng)納米顆粒與siRNA的重量比(w:w)為10:1時(shí),siRNA可以*負(fù)載。終的重量比為20:1,以供進(jìn)一步研究。通過免疫熒光(圖2E)和Western blotting實(shí)驗(yàn)(圖2F)驗(yàn)證了負(fù)載siMCT-4的納米顆粒對(duì)B16F10細(xì)胞中MCT-4表達(dá)的影響。結(jié)果表明,與其他組相比,負(fù)載siMCT-4的納米顆粒能有效抑制MCT-4的表達(dá)。
圖2
3.乳酸對(duì)體外巨噬細(xì)胞極化的影響
通過RAW264.7細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞(B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證乳酸對(duì)體外巨噬細(xì)胞表型極化的影響(圖3A)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明,HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4顯著沉默了B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞中MCT-4的表達(dá)(圖3B)。經(jīng)HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4處理后,共培養(yǎng)液(RAW264.7細(xì)胞與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng))中的細(xì)胞外乳酸含量較其他處理低(圖3C)。同時(shí),B16F10細(xì)胞的胞內(nèi)乳酸含量高于其他處理(圖3D)。以上結(jié)果與RAW264.7細(xì)胞與4T1細(xì)胞共培養(yǎng)模型的結(jié)果高度一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4可以抑制MCT-4的表達(dá),并進(jìn)一步抑制B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞的乳酸外流。
圖3
流式細(xì)胞儀檢測(cè)M1型標(biāo)記物CD86和M2型標(biāo)記物CD206的表達(dá)。結(jié)果提示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組M1型巨噬細(xì)胞比例明顯增加。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+forskolin組CD86表達(dá)下調(diào),CD206表達(dá)上調(diào)。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+乳酸組也表現(xiàn)出與HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組相反的趨勢(shì),說明培養(yǎng)基中的乳酸在巨噬細(xì)胞表型極化中起著重要作用。此外,與僅用DMEM培養(yǎng)基組相比,B16F10或4T1細(xì)胞共培養(yǎng)組中CD86和CD206的表達(dá)略有上調(diào)(圖3E,F(xiàn))。采用免疫熒光法檢測(cè)不同處理后CD86和CD206的表達(dá)情況。從CLSM圖像中可以看到HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組CD86表達(dá)明顯增加,CD206表達(dá)明顯減少(圖3G,H)。其他組的結(jié)果及相關(guān)熒光定量統(tǒng)計(jì)(圖3I,J)與FCM檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。以上結(jié)果表明,HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在體外通過抑制乳酸外流顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表型向M1型極化。
4.納米平臺(tái)的細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
本研究中,HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在體外可顯著抑制B16F10和4T1細(xì)胞活力,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Western blotting檢測(cè)不同處理后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。WB結(jié)果顯示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4組顯著誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞中Bax的表達(dá),但Bcl-2的表達(dá)受到抑制(圖4A),蛋白灰度定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致(圖4B)。結(jié)果顯示,兩組均具有較高的細(xì)胞毒性,可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。與其他組相比,也顯著抑制了B16F10和4T1細(xì)胞活力(圖4C)。為了進(jìn)一步研究負(fù)載HCPT和siMCT-4的納米平臺(tái)的細(xì)胞毒性,作者使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒確認(rèn)不同處理后的細(xì)胞毒性(圖4D)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示兩組均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,且有時(shí)間依賴性。HMONs-BSA-PEI-CDM-PEG具有輕微的細(xì)胞毒性。
圖4
5.利用納米平臺(tái)通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)乳酸外流激活巨噬細(xì)胞M2到M1極化和恢復(fù)體內(nèi)T細(xì)胞活性
為了驗(yàn)證MCT-4在體內(nèi)沉默的有效性,我們?cè)诟鞣N治療后處死B16F10或4T1荷瘤Balb/c小鼠。對(duì)B16F10腫瘤組織(圖5A)和4T1腫瘤組織(圖5H)進(jìn)行Western blotting檢測(cè)MCT-4的表達(dá)。結(jié)果顯示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組抑制了MCT-4的表達(dá)。此外,通過檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞中乳酸含量和TME中乳酸含量,證明通過抑制乳酸在體內(nèi)的外流,腫瘤細(xì)胞中乳酸含量增加,TEM中乳酸含量降低。從相關(guān)結(jié)果(圖5C,D,I,J)中,作者發(fā)現(xiàn)HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM@siMCT-4+Forskolin和HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組顯著抑制了B16F10和4T1荷瘤小鼠的乳酸外流量。
圖5
接下來作者研究了抑制乳酸外流對(duì)TAM表型極化和恢復(fù)體內(nèi)CD8+T細(xì)胞活性的影響,結(jié)果表明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組明顯降低了M2型TAMs的百分比(圖5D,F(xiàn),K,M),同時(shí)增加了M1型TAMs的能力(圖5E,F(xiàn),L,M)。免疫熒光法檢測(cè)B16F10腫瘤組織中TAM標(biāo)記物(CD11b)、M2型標(biāo)記物(CD206)和M1型標(biāo)記物(CD86)的表達(dá)。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組抑制了CD206的表達(dá),誘導(dǎo)了CD86的表達(dá),這與B16F10腫瘤組織的FCM檢測(cè)結(jié)果一致。檢測(cè)了B16F10或4T1腫瘤組織中Treg細(xì)胞的百分比,驗(yàn)證了工程化的納米平臺(tái)清除免疫抑制TME的效率。以上結(jié)果證實(shí)HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4在體內(nèi)通過抑制乳酸外流的作用,有效地將TAMs的表型從M2型極化為M1型,降低Treg細(xì)胞的百分比,恢復(fù)CD8+T細(xì)胞的活性。
6.體內(nèi)對(duì)腫瘤組織免疫應(yīng)答的恢復(fù)及對(duì)肺腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制
進(jìn)一步討論抑制乳酸外流在免疫抑制TME和激活體內(nèi)免疫應(yīng)答中的作用,相關(guān)結(jié)果表明,HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組的相關(guān)免疫細(xì)胞比例明顯高于其他組(圖6A,B),證明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在體內(nèi)通過抑制乳酸外流,顯著緩解免疫抑制TME,激活免疫應(yīng)答。采用免疫熒光法檢測(cè)B16F10腫瘤組織中的免疫促進(jìn)因子(IFNγ、TNF-α)和免疫抑制因子(Arg1、TGF-β),分析其抗腫瘤作用機(jī)制。根據(jù)CLSM圖像,HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組顯著誘導(dǎo)免疫促進(jìn)因子表達(dá)(圖6B),降低免疫抑制因子表達(dá)(圖6D)。對(duì)應(yīng)的熒光定量統(tǒng)計(jì)(圖6H)與FCM和IF檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致。上述結(jié)果表明,在免疫抑制TME中,乳酸是主要的免疫調(diào)節(jié)因子。通過抑制乳酸外流可以有效地將免疫抑制型腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”型腫瘤,在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答。
圖6
有研究表明,免疫抑制TME中乳酸含量與腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有報(bào)道使用Balb/c小鼠肺轉(zhuǎn)移模型來證明HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4對(duì)B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響(圖6C)。經(jīng)不同處理后,肺組織圖像顯示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組明顯抑制肺轉(zhuǎn)移,減少了B16F10細(xì)胞(圖6D,E)和4T1細(xì)胞(圖6F,G)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成。此外,H&E染色結(jié)果還顯示HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4組B16F10細(xì)胞和4T1細(xì)胞通過抑制乳酸外流轉(zhuǎn)移到肺組織。
7.體內(nèi)抗腫瘤效能
利用B16F10和4T1荷瘤小鼠研究HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4在體內(nèi)的抗腫瘤效能(圖7A)。從圖7B的荷瘤圖像來看,HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組與其他組相比,腫瘤生長明顯受到抑制。相關(guān)腫瘤體積(V/V0)結(jié)果(圖7C)與荷瘤小鼠圖像趨勢(shì)一致。腫瘤組織重量結(jié)果顯示HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組體內(nèi)抗腫瘤效果好(圖7D)。進(jìn)一步研究體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況,圖7E和F證實(shí)HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4組明顯誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡。相關(guān)的荷瘤生存率結(jié)果表明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4具有顯著的抗腫瘤效果,并顯著延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。
接下來揭示了HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4對(duì)Balb/c小鼠的生物相容性和細(xì)胞毒性,荷瘤小鼠的體重證明HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4在體內(nèi)具有良好的生物相容性。此外,HE染色圖像顯示HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4對(duì)主要臟器無毒副作用,而HCPT組肝臟毒性較輕,這與其他研究一致。
為了研究停止治療21天后腫瘤的復(fù)發(fā),給4T1荷瘤小鼠用藥。從圖7E中4T1荷瘤小鼠的圖像來看,與其他組相比,HMONs@HCPT-BSA-PEICDM-PEG@siMCT-4組能顯著抑制腫瘤生長。相關(guān)腫瘤體積(V/V0)結(jié)果(圖7F)與荷瘤小鼠圖像趨勢(shì)一致。腫瘤組織重量結(jié)果顯示,HMONs@ HCPT-BSA-PEI-CDM-PEG@siMCT-4組抗腫瘤效果優(yōu)于其他組(圖7G)。相關(guān)的腫瘤體積(V / V0)證明了HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4組在停止治療后激活了免疫反應(yīng)而顯著抑制腫瘤復(fù)發(fā)。從這些結(jié)果來看,HMONs@HCPT-BSAPEI-CDM-PEG@siMCT-4在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果,明顯延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間,并有效抑制腫瘤復(fù)發(fā)。
圖7
結(jié) 論
在本研究中,作者構(gòu)建了一種納米藥物和siRNA傳遞系統(tǒng),用于消除免疫抑制TME,抑制腫瘤生長,減少腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移。HMONs@HCPT-BSA-PEI-CDMPEG@siMCT-4納米平臺(tái)可顯著抑制MCT-4的表達(dá)并抑制乳酸外流。與此同時(shí),納米藥物和siRNA系統(tǒng)通過體外抑制乳酸外流,顯著誘導(dǎo)RAW264.7表型向M1型極化。此外,納米平臺(tái)顯著消除免疫抑制的TME,將TAMs表型極化為M1型,恢復(fù)體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的活性。此外,它還能顯著激活免疫應(yīng)答,增強(qiáng)腫瘤組織中免疫促進(jìn)細(xì)胞的浸潤,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。綜上所述,級(jí)聯(lián)響應(yīng)性納米平臺(tái)可通過抑制乳酸外流和HCPT來調(diào)節(jié)免疫抑制的TME,從而增強(qiáng)腫瘤化療免疫治療。
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