免疫組織化學(xué)(簡(jiǎn)稱免疫組化)是組織化學(xué)的一種,它是利用已知的特異性抗體與抗原能特異性結(jié)合的特點(diǎn),通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑,如酶、金屬離子、同位素等,顯示一定的顏色,并借助顯微鏡觀察其顏色的變化,從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成份或化學(xué)性質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括切片制作(固定,脫水,透明,包埋,切片,貼片,烤片),脫蠟,水化,阻斷,抗原修復(fù),封閉,一抗孵育,二抗孵育,顯色,復(fù)染,封片,分析。
IHC是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的應(yīng)用技術(shù),應(yīng)用過(guò)程中常出現(xiàn)各種問(wèn)題,例如檢測(cè)結(jié)果陰性,非特異性染色,染色強(qiáng)度不夠,著色不均,脫片,干片等。因此索萊寶為大家總結(jié)了一些IHC常見問(wèn)題及處理方法,來(lái)幫助您改進(jìn)IHC檢測(cè),減少您的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過(guò)程,快速達(dá)到預(yù)期結(jié)果。
IHC常見問(wèn)題
Q
固定液的選擇
A:
a)甲醛:甲醛是保留組織和細(xì)胞內(nèi)蛋白靶點(diǎn)的常用固定劑,是大多數(shù)IHC/ICC應(yīng)用的良好選擇,但并不是一種通用的固定劑。醛的過(guò)度固定會(huì)修飾氨基酸(屬于表位中的一部分),并阻斷抗體與之結(jié)合。然而大部分情況下,利用抗原修復(fù)技術(shù)可暴露表位,以還原抗體結(jié)合。研究表明甲醛會(huì)誘導(dǎo)磷酸化依賴表位的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位,從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)。在這種情況下,冰預(yù)冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇是適當(dāng)?shù)奶娲?/p>
b)醇類:常用于細(xì)胞和組織固定的醇類是甲醇和乙醇。通常認(rèn)為醇類不像甲醛固定劑那樣保留組織形態(tài),不像甲醛那樣滲透,主要用于固定冰凍組織切片和細(xì)胞。在醇類固定之后不推薦進(jìn)行抗原修復(fù)。
c)丙酮:丙酮是一種強(qiáng)的脫水劑,能引起組織蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷凍組織的切片。
Q
細(xì)胞和組織常用的固定方法
A:
a)培養(yǎng)細(xì)胞:培養(yǎng)細(xì)胞的固定時(shí)間與組織相比較短,且固定液的濃度更低。例如,用2%甲醛溶液在室溫下固定20min,足以保留細(xì)胞形態(tài)和抗原性。
培養(yǎng)細(xì)胞的固定通常只是去除培養(yǎng)基,并加入固定液即可。不過(guò),去除培養(yǎng)基后表面張力的變化可能損害某些細(xì)胞類型。如果是這種情況,固定劑可直接加入培養(yǎng)基中。例如,加入與培養(yǎng)基相同體積的4%甲醛,將得到2%甲醛溶液,它足以預(yù)固定細(xì)胞。2min后,預(yù)固定培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)替換成新鮮的2%固定劑。預(yù)固定步驟讓細(xì)胞更加堅(jiān)硬,這樣它們就能夠承受表面張力改變所引起的任何可能的有害影響。
b)組織:對(duì)于小組織來(lái)說(shuō),浸入固定溶液通常能獲得足夠的固定??蓪⒔馄实慕M織浸潤(rùn)在固定劑中,但是如果將固定溶液經(jīng)由內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)(無(wú)論是通過(guò)心臟或通過(guò)腹主動(dòng)脈)灌注,則往往能獲得更快速、更均勻的固定。在研究小動(dòng)物的完整組織時(shí),灌注固定是保留抗原的佳方法,包括用固定液來(lái)取代動(dòng)物的全身血液。4%甲醛是組織灌注和浸潤(rùn)固定的常用溶液。
為了在浸潤(rùn)固定過(guò)程中加強(qiáng)固定劑的滲透,建議組織厚度不超過(guò)5mm。對(duì)于完整的固定,固定劑的體積應(yīng)當(dāng)是組織體積的50-100倍。固定通常在室溫下進(jìn)行4-24小時(shí)。由于固定不足或固定過(guò)度可能降低或破壞組織的免疫反應(yīng)性,因此優(yōu)化條件很重要。
Q
抗原修復(fù)方法
A:
由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中,發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用,從而掩蓋抗原決定簇,通過(guò)抗原修復(fù),使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露,提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方式一般分三種:高壓修復(fù)、微波修復(fù)、酶修復(fù)。
a)高壓修復(fù)是目前使用較多、較穩(wěn)定、可重復(fù)性較高的一種方法,操作簡(jiǎn)單,效果較好。但這種方法對(duì)修復(fù)的溫度和時(shí)間要求十分嚴(yán)格。我們常用的高壓鍋修復(fù),溫度在110℃左右,修復(fù)時(shí)間為2.5min。
b)微波修復(fù)是較早采用的熱抗原修復(fù)技術(shù),其方法受環(huán)境因素影響較大。微波修復(fù)偶爾也會(huì)出現(xiàn)同時(shí)修復(fù)的組織切片中以及同一切片的不同部位可能會(huì)出現(xiàn)修復(fù)效果不均勻的現(xiàn)象。比較適合高pH值的抗原修復(fù)液(EDTA、EGTA)修復(fù)。
c)酶修復(fù)法比較溫和,常用于脫片現(xiàn)象較嚴(yán)重的切片(如骨組織切片)。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。酶消化法進(jìn)行抗原修復(fù),須嚴(yán)格控制濃度和作用時(shí)間,消化不足,不能充分暴露出組織抗原;過(guò)度的消化會(huì)破壞組織結(jié)構(gòu),陽(yáng)性定位不明確。我們常用蛋白酶K修復(fù),條件為37℃ 10min。
Q
為什么要滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性?
A:
內(nèi)源性過(guò)氧化物酶會(huì)與基質(zhì)溶液(過(guò)氧化氫和顯色劑,例如DAB)發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致假陽(yáng)性。在與HRP偶聯(lián)抗體一起孵育之前,先用過(guò)氧化氫預(yù)處理樣本可以顯著降低這種非特異性背景。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶一般用3%過(guò)氧化氫孵育10min左右。
Q
IHC實(shí)驗(yàn)中有脫片現(xiàn)象
A:
Q
IHC染色出現(xiàn)定位不準(zhǔn)確現(xiàn)象
A:
Q
染色后有邊緣效應(yīng)
A:
Q
IHC實(shí)驗(yàn)存在非特異性染色或顯色過(guò)度
A:
Q
IHC染色結(jié)果顯色較弱
A:
Q
IHC實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果是陰性
A:
Q
IHC實(shí)驗(yàn)染色不均勻
A:
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