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      首頁(yè) > 技術(shù)文章 > 定位重塑型納米凝膠介導(dǎo)共遞送抗血管藥物自噬抑制劑,實(shí)現(xiàn)腫瘤的協(xié)同治療
      定位重塑型納米凝膠介導(dǎo)共遞送抗血管藥物自噬抑制劑,實(shí)現(xiàn)腫瘤的協(xié)同治療

       腫瘤是一種復(fù)雜難治的疾病,對(duì)人類(lèi)健康存在重大威脅。當(dāng)腫瘤體積超過(guò)2-3mm3時(shí),腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散主要依靠自身的血管系統(tǒng)來(lái)提供必要的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。而在缺乏血管的情況下,腫瘤具有自限性生長(zhǎng)的特點(diǎn)。因此,將腫瘤血管作為靶點(diǎn),抑制它的形成或破壞其存在,直接切斷腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的營(yíng)養(yǎng)通道,是一個(gè)有吸引力的治療策略。

      目前,根據(jù)作用機(jī)制的不同,血管靶向藥物(VTAs)主要包括兩大類(lèi):血管生成抑制劑(AIs)和血管阻斷劑(VDAs)。在VDAs中,康普瑞?。–A4)作為常用的小分子血管阻斷劑,具有良好的抗血管活性,但其水溶性較差,難以通過(guò)血管給藥。所以,利用納米技術(shù)開(kāi)發(fā)合適的遞藥體系可以有效改善CA4小分子藥物的缺陷,為其臨床應(yīng)用提供一個(gè)新策略。

      納米凝膠具有良好的水分散性、優(yōu)異的生理穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)可塑性。其中常作為藥用輔料的海藻酸鈉(Alg)因具有良好的生物相容性、可生物降解、廉價(jià)無(wú)毒以及易于凝膠化等優(yōu)點(diǎn)受到大的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),Alg可以通過(guò)與多種過(guò)渡金屬陽(yáng)離子交聯(lián)形成“蛋-盒”型螺旋水凝膠。Fe3+可與Alg交聯(lián)形成穩(wěn)定的水凝膠,但當(dāng)Fe3+經(jīng)可見(jiàn)光或抗壞血酸等光電化學(xué)還原為Fe2+后,F(xiàn)e2+與Alg的交聯(lián)能力迅速減弱,導(dǎo)致水凝膠自外而內(nèi)進(jìn)行解離,然后溶解。腫瘤微環(huán)境(TME)可作為鐵離子發(fā)生氧化態(tài)轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)劑,實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤的定點(diǎn)釋放。

      基于上述背景,鄭州大學(xué)藥物研究院張慧娟課題組*設(shè)計(jì)了一種定位重塑型納米凝膠CA4-FeAlg/HCQ。在CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠到達(dá)腫瘤部位后,首先在腫瘤血管釋放CA4,阻斷外源性營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死。隨后FeAlg/HCQ分解成小納米粒穿透到腫瘤組織深部,F(xiàn)e3+在低pH、高GSH條件下還原為Fe2+,納米凝膠自外而內(nèi)快速解離,HCQ持續(xù)釋放。此外,F(xiàn)e2+可與瘤內(nèi)H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng),產(chǎn)生強(qiáng)細(xì)胞毒性的•OH,進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤作用。該研究為利用納米載體系統(tǒng)提高瘤內(nèi)藥物遞送效率提供了一種有效的遞送策略,并為增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答提高腫瘤治療效果提供了一種有意義的探索。

      圖1

       

       

       

       
       
       

      基本信息

      題目:

      Positioning Remodeling Nanogels Mediated Codelivery of Antivascular Drug and Autophagy Inhibitor for Cooperative Tumor Therapy

      期刊:ACS Applied Materials & Interfaces

      影響因子:8.758

      PMID: 31951366 

      作者:張紅嶺副教授

      通訊作者:張慧娟教授

      作者單位:鄭州大學(xué)藥物研究院

      索萊寶合作產(chǎn)品:

      產(chǎn)品名稱(chēng)

      產(chǎn)品貨號(hào)

      Combretastatin A4 康普瑞汀

      IC1440

      Earle's Balanced Salt Solution EBSS

      H2045

      The micro H2O2 assay kit 

      過(guò)氧化氫(H2O2)含量檢測(cè)試劑盒

      BC3590

       

      摘 要

      腫瘤血管系統(tǒng)和增強(qiáng)的自噬共同為腫瘤的生長(zhǎng)、增殖與轉(zhuǎn)移供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。阻斷外界營(yíng)養(yǎng)供給,實(shí)現(xiàn)腫瘤饑餓治療,將是一種有前途的抗腫瘤方法。本研究中,作者構(gòu)建了一種具有定位重塑功能的智能納米凝膠CA4-FeAlg/HCQ,可以殺死A549癌細(xì)胞。CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在,當(dāng)它們到達(dá)腫瘤血管環(huán)境時(shí),首先釋放血管阻斷劑康普瑞?。–A4),發(fā)揮抗血管作用。此后,F(xiàn)eAlg/HCQ解體為小納米凝膠(<30nm),有利于向腫瘤組織的深部滲透。進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后,F(xiàn)eAlg/HCQ納米凝膠將發(fā)生相重構(gòu)(凝膠→溶膠),從而快速釋放出自噬抑制劑羥氯喹(HCQ)。CA4-FeAlg納米凝膠誘導(dǎo)的自噬可被HCQ有效抑制,從而實(shí)現(xiàn)抗血管與自噬抑制協(xié)同治療腫瘤的目的?;钚匝踅Y(jié)果顯示,在腫瘤微環(huán)境下,F(xiàn)eAlg中的Fe3+還原為Fe2+后,可以通過(guò)芬頓反應(yīng)有效產(chǎn)生•OH,進(jìn)一步殺死腫瘤細(xì)胞。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,CA4-FeAlg/HCQ的體內(nèi)治療效果佳,相對(duì)腫瘤體積終可下降至0.40±0.10。本研究將為藥物的共遞送和聯(lián)合應(yīng)用提供一個(gè)有前景的策略。

       

      研究結(jié)果

       
       
       

      1.CA4-FeAlg/HCQ納米顆粒的制備與表征

      CA4-FeAlg/HCQ的制備過(guò)程如圖1A所示。按圖2A步驟合成Alg-CA4偶聯(lián)物,圖2B表明CA4成功連接到Alg分子上。CA4是通過(guò)新的酯鍵合成,成功接至Alg骨架上(圖2C)。制備的Alg-CA4可通過(guò)核磁共振氫譜進(jìn)一步研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖2D)。TEM直觀顯示CA4-FeAlg納米凝膠的形態(tài)為類(lèi)球形,尺寸分布相對(duì)均勻(圖2E、F)。CA4-FeAlg平均水合粒徑約為150nm(圖2G)。以Fe3+為交聯(lián)劑合成的CA4-FeAlg平均電位值從-21.9mV變?yōu)?.23mV(圖2H)。

      選擇自噬抑制劑HCQ作為聯(lián)用藥物協(xié)同治療腫瘤。將CA4-FeAlg凍干粉在HCQ溶液中緩慢溶脹,更多的HCQ分子隨著水分子進(jìn)入納米凝膠網(wǎng)絡(luò)中。如圖2I所示,投藥比為1:2是優(yōu)制備條件。CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠的粒徑分布范圍依然較窄,終水合粒徑為165nm(圖2J)。在進(jìn)一步載藥后,CA4-FeAlg/HCQ的平均電位值也由9.23mV變?yōu)?13.1mV(圖3A)。

      圖2

      2.藥物釋放能力的評(píng)估

      研究者采用pH7.4+10%BSA溶液模擬血液生理環(huán)境。在這種介質(zhì)溶液中,48h內(nèi)只有17%的CA4從CA4-FeAlg中釋放出來(lái)(圖3B)。此外由釋放曲線(xiàn)可知,CA4的釋放具有pH依賴(lài)性(圖3B)。與在pH5.5介質(zhì)溶液中相比,置于pH7.4介質(zhì)溶液中(模擬腫瘤血管環(huán)境)的CA4釋放速率更快,其累積釋藥百分率在12h內(nèi)甚至達(dá)到92.12%(圖3C)。CA4釋放后的納米凝膠仍保留原始結(jié)構(gòu)(圖3D),與直接合成的FeAlg結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯差異(圖3E)。這一結(jié)果說(shuō)明,CA4-FeAlg納米凝膠在血液循環(huán)過(guò)程中可以穩(wěn)定存在,而在腫瘤血管處CA4可以快速釋放出來(lái)。

      接下來(lái),用同樣的方法評(píng)估了HCQ在CA4-FeAlg/HCQ體系中的釋放特性(圖3F)。從圖3F可以看出,HCQ在有GSH存在的介質(zhì)中釋放速度明顯加快。這一現(xiàn)象歸因于在GSH的還原條件下,納米凝膠中的Fe3+被還原為Fe2+,F(xiàn)e2+與Alg的親和作用降低,納米凝膠自外而內(nèi)進(jìn)行解離,從而實(shí)現(xiàn)HCQ的有效釋放。在弱酸性環(huán)境中(pH5.5+5mM GSH,模擬腫瘤細(xì)胞)這種現(xiàn)象表現(xiàn)更明顯,24h時(shí)HCQ的累積釋藥率可達(dá)到95.07%,而pH7.4+10%BSA介質(zhì)中HCQ釋放較慢。以上結(jié)果表明,CA4-FeAlg/HCQ遞藥體系在血液和正常組織中能夠保持相對(duì)穩(wěn)定,而蓄積到腫瘤部位后CA4和HCQ可在各個(gè)靶向位點(diǎn)連續(xù)釋放。

      圖3

      3.細(xì)胞攝取和溶酶體共定位

      如圖4A所示,F(xiàn)eAlg納米凝膠可被A549細(xì)胞高效攝取,實(shí)現(xiàn)藥物的有效遞送。為了進(jìn)一步探索FeAlg在細(xì)胞內(nèi)的分布,利用LSCM對(duì)納米凝膠與細(xì)胞器的共定位現(xiàn)象進(jìn)行了可視化研究。如圖4B所示,由于游離FITC無(wú)法進(jìn)入A549細(xì)胞,視野中未發(fā)現(xiàn)綠色熒光,F(xiàn)eAlg/FITC組在共孵育0.5h時(shí),胞質(zhì)內(nèi)首先觀測(cè)到微弱的綠色熒光,熒光灰度值顯示FeAlg與溶酶體的平均共定位系數(shù)為0.15±0.03。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移,細(xì)胞中的綠色熒光也在一直不斷增多并且逐漸聚集于溶酶體,在1h和3h時(shí),平均共定位系數(shù)分別增加到0.49±0.07和0.74±0.09。以上結(jié)果顯示溶酶體可能成為FeAlg/HCQ納米凝膠遞藥系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用的有效靶點(diǎn)。

      圖4

      4.溶酶體損傷與自噬抑制

      當(dāng)納米凝膠被腫瘤細(xì)胞攝取并蓄積在溶酶體內(nèi)后,F(xiàn)e3+在高GSH作用下轉(zhuǎn)化為Fe2+,在這種特殊的微環(huán)境中Fe2+又可與瘤內(nèi)H2O2引起“芬頓”反應(yīng)生成•OH(圖5A),導(dǎo)致溶酶體破裂,從而使自噬溶酶體的形成及降解受到嚴(yán)重阻礙。藥物處理6h后,細(xì)胞內(nèi)pH變化趨勢(shì)如圖5B所示。與空白組相比,HCQ和CA4-FeAlg/HCQ組的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng),表明細(xì)胞內(nèi)pH值顯著升高。

      為了研究•OH和pH值變化對(duì)溶酶體穩(wěn)定性的影響,用LSCM記錄溶酶體的變化情況。如圖5C和圖5D所示,空白對(duì)照組中所有細(xì)胞的溶酶體形態(tài)完整,聯(lián)合•OH和pH升高對(duì)溶酶體的破壞效應(yīng),CA4-FeAlg/HCQ處理組中平均熒光密度驟降至25.44,僅為對(duì)照組的2.28%。由此表明,F(xiàn)eAlg和HCQ可以共同作用于溶酶體。

      接下來(lái),作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí),對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬水平的影響。圖5E顯示,與DMEM組相比,在EBSS組中出現(xiàn)了顯著的LC3蛋白的陽(yáng)性自噬體。HCQ和CA4-FeAlg/HCQ處理后,細(xì)胞內(nèi)的LC3蛋白表達(dá)均顯著增加。這是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后,•OH引起的溶酶體膜的不穩(wěn)定和HCQ引起的溶酶體酸性環(huán)境的破壞可以協(xié)同抑制自噬小體的降解,導(dǎo)致大量自噬體的積累。LC3-II:LC3-I值也為證明CA4-FeAlg/HCQ通過(guò)抑制自噬引起自噬體累積提供了依據(jù)。以上結(jié)果表明,CA4-FeAlg/HCQ在無(wú)營(yíng)養(yǎng)情況下能有效抑制腫瘤細(xì)胞自噬。

      圖5

      5.體外腫瘤深部滲透與細(xì)胞毒性

      通過(guò)體外模擬TME,研究CA4-FeAlg納米凝膠的形態(tài)變化。在pH6.5,20μM GSH的介質(zhì)中,CA4-FeAlg已經(jīng)明顯解體為小納米凝膠,水合粒徑減小為27nm左右(圖6A)。而當(dāng)酸性變強(qiáng),GSH濃度增加后,CA4-FeAlg納米凝膠自外向內(nèi)解離,發(fā)生了相重構(gòu),大多數(shù)納米凝膠的粒徑變得更小甚至溶解(圖6B)。這是因?yàn)镕eAlg納米凝膠的交聯(lián)劑Fe3+可以被GSH迅速還原為Fe2+。Fe2+與Alg的相互作用較弱導(dǎo)致FeAlg結(jié)構(gòu)從外向內(nèi)解離。

      研究者利用3DMCS模型考察體外深部滲透效果。如圖6C表明SiO2納米粒子很難擴(kuò)散到腫瘤深部。而在80μm深度時(shí),F(xiàn)eAlg/FITC組中有強(qiáng)烈的綠色熒光分布在腫瘤球的中央?yún)^(qū)域。120μm深度時(shí),F(xiàn)eAlg/FITC+10mM GSH組中有更多的綠色熒光分布于腫瘤球的中央范圍內(nèi),其相對(duì)熒光強(qiáng)度是SiO2/FITC組的12倍。圖6D顯示,F(xiàn)eAlg/FITC+10mM GSH組的相對(duì)熒光強(qiáng)度均高于其他兩組。以上結(jié)果表明FeAlg納米凝膠分裂成小的納米顆粒后,利于實(shí)現(xiàn)腫瘤的深部滲透。

      圖6

      CA4-FeAlg和CA4-FeAlg/HCQ的細(xì)胞毒性明顯集中,呈一定的時(shí)間依賴(lài)性(圖6E和F)。選擇CA4前藥CA4P作為陽(yáng)性對(duì)照組。CA4-FeAlg組的細(xì)胞抑制率均明顯高于CA4P組,表明CA4-FeAlg納米凝膠可作為CA4前藥用于腫瘤治療。此外,如圖6F所示,CA4-FeAlg/HCQ對(duì)A549細(xì)胞的毒性強(qiáng)。當(dāng)藥物濃度為20μg/mL,作用時(shí)間為48h時(shí),CA4-FeAlg/HCQ組的細(xì)胞抑制率甚至達(dá)到93.86±4.78%。此外,觀察CA4-FeAlg/HCQ組的活細(xì)胞數(shù)(綠色)少(圖6G)。基于以上結(jié)果,CA4-FeAlg/HCQ可在體外有效殺傷A549腫瘤細(xì)胞。

      6.體內(nèi)腫瘤的靶向性與穿透性

      如圖7A所示,游離的IR783廣泛分布于裸鼠體內(nèi),并在體內(nèi)被迅速清除。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),腫瘤內(nèi)的熒光信號(hào)大幅度減弱。而FeAlg/IR783和CA4-FeAlg/IR783組腫瘤區(qū)域的熒光信號(hào)都在逐漸增加,在8h時(shí)達(dá)到高。隨后,F(xiàn)eAlg/IR783組腫瘤內(nèi)的熒光強(qiáng)度迅速下降,24h時(shí)僅存在微弱熒光。然而,CA4-FeAlg/IR783在24h仍有較強(qiáng)的熒光。體外成像結(jié)果(圖7B)顯示游離IR783主要在肝、腎組織內(nèi)分布,F(xiàn)eAlg/IR783主要存在于肝組織,腎、肺和腫瘤組織中也有少量分布。CA4-FeAlg/IR783主要存在于腫瘤組織,這歸因于CA4與β-微管蛋白上的秋水仙堿受體結(jié)合。以上結(jié)果進(jìn)一步證明CA4-FeAlg/IR783具有優(yōu)異的腫瘤靶向性,有助于藥物在腫瘤部位大量蓄積。

      作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在腫瘤組織內(nèi)的深部穿透性能。如圖7C和7D所示,粒徑穩(wěn)定的SiO2/FITC腫瘤組織穿透性較差,主要分布在腫瘤血管周?chē)H欢?,F(xiàn)eAlg/FITC組中的穿透距離顯著增大。上述結(jié)果均表明CA4-FeAlg可以將治療藥物高效遞送至腫瘤部位,并均勻滲透到實(shí)體瘤組織中。

      圖7

      7.體內(nèi)抗腫瘤效果和安全性評(píng)價(jià)

      為了系統(tǒng)性評(píng)價(jià)CA4-FeAlg/HCQ的抗癌性能,作者研究了CA4-FeAlg/HCQ在A549荷瘤裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用。如圖7E所示,N.S.組的相對(duì)腫瘤體積一直在升高,終達(dá)到1.96±0.17。CA4P對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有一定程度的抑制作用,但腫瘤體積波動(dòng)較大。相比之下,CA4-FeAlg能夠顯著抑制A549腫瘤的生長(zhǎng),揭示CA4-FeAlg作為新型的CA4前藥具有良好的抗腫瘤效果。CA4-FeAlg/HCQ的治療效果佳,治療終點(diǎn)時(shí)的腫瘤體積?。▓D7F)。CA4-FeAlg/HCQ的佳抗腫瘤作用可能來(lái)源于以下三個(gè)機(jī)制:其一,CA4破壞腫瘤血管系統(tǒng)切斷外源性營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死;其二,F(xiàn)eAlg通過(guò)響應(yīng)TEM生成ROS產(chǎn)生細(xì)胞毒性;其三,CA4誘導(dǎo)的自噬被HCQ抑制,阻斷腫瘤細(xì)胞的內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)通道。接下來(lái),研究者逐一驗(yàn)證了這些可能的機(jī)制。

      如圖8A所示,N.S.組中的腫瘤血管相對(duì)完整、豐富。然而,CA4P組中的腫瘤血管密度明顯降低。在CA4-FeAlg組,腫瘤血管數(shù)量少,細(xì)胞之間的空隙也變大。接下來(lái),作者對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的•OH含量進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖8B),F(xiàn)eAlg給藥組的腫瘤細(xì)胞中•OH含量明顯增加,熒光強(qiáng)度是N.S.組的3.58倍。由此表明,F(xiàn)eAlg在腫瘤細(xì)胞中可以通過(guò)芬頓反應(yīng)高效快速的產(chǎn)生大量•OH。研究者采用免疫組化與TEM表征對(duì)CA4-FeAlg/HCQ抑制腫瘤細(xì)胞自噬的情況進(jìn)行考察。如圖8C所示,與N.S.和CA4-FeAlg組相比,HCQ和CA4-FeAlg/HCQ組自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)明顯升高,其中以CA4-FeAlg/HCQ組表達(dá)水平高。此外,TEM結(jié)果(圖8D)也證明,經(jīng)CA4-FeAlg/HCQ處理后的腫瘤細(xì)胞中顯著存在大量累積的自噬泡(黃色箭頭指示)。這再次提示CA4-FeAlg抗血管治療誘導(dǎo)的自噬可被HCQ有效抑制,從而實(shí)現(xiàn)抗血管與自噬抑制協(xié)同治療腫瘤的目的。

      研究者記錄了治療期間荷瘤小鼠的體重。如圖8E所示,各組之間的荷瘤鼠體重沒(méi)有發(fā)生急劇下降的現(xiàn)象,治療期間的變化趨勢(shì)基本相同,沒(méi)有顯著性差異,說(shuō)明CA4-FeAlg/HCQ納米凝膠相對(duì)安全,毒副作用較小。各組心、肝、脾、肺、腎、腦組織均無(wú)明顯病理改變,進(jìn)一步證明了CA4-FeAlg/HCQ的生物安全性。

      圖8

       

      研究結(jié)論

       

      綜上所述,研究者成功構(gòu)建了定位重塑型納米凝膠(CA4-FeAlg/HCQ),用于共遞送血管阻斷劑CA4與自噬抑制劑HCQ,實(shí)現(xiàn)了CA4和HCQ在腫瘤血管和腫瘤細(xì)胞中的連續(xù)釋放,以及對(duì)A549非小細(xì)胞肺癌的協(xié)同治療。另外,F(xiàn)eAlg可催化瘤內(nèi)H2O2產(chǎn)生強(qiáng)細(xì)胞毒性的•OH,進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤作用。該系統(tǒng)將為藥物的共遞送和聯(lián)合應(yīng)用提供了一個(gè)有前景的策略。

       

      索萊寶產(chǎn)品亮點(diǎn)

       

       

      相關(guān)產(chǎn)品

      產(chǎn)品名稱(chēng)

      產(chǎn)品貨號(hào)

      Combretastatin A4

      康普瑞汀

      IC1440

      Hydroxychloroquine Sulfate 

      硫酸羥氯喹

      IH0720

      Glutathione reduced 

      還原型谷胱甘肽

      IG0870

      FITC 異硫氰酸熒光素

      IF0080

      Paclitaxel 紫杉醇

      IP0020

      Docetaxel  多西他賽

      ID0400

      Vincristine sulfate

      硫酸長(zhǎng)春新堿

      IV0290

      Epothilone B 埃博霉素 B

      IE0780

      Trigonelline 葫蘆巴堿

      IT0660

      Nocodazole 諾考達(dá)唑

      IN0710

      Cabazitaxel 卡巴他賽

      IC0010

      Epothilone A 埃博霉素 A

      IE0770

      Albendazole 阿苯達(dá)唑

      IA0140

      Vindoline 文多靈

      IV0270

      Griseofulvin 灰黃霉素

      IG0440

      丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒

      BC0025

      多酚氧化酶(PPO)活性檢測(cè)試劑盒

      BC0195

      超氧陰離子含量檢測(cè)試劑盒

      BC1295

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