1、PB@PDA@Ag的構(gòu)建與表征

按照方案一將PB置于最里層，PDA包裹PB后充當(dāng)納米Ag的載體構(gòu)建PB@PDA@Ag。TEM結(jié)果表明：PB NP平均尺寸約為88 nm，PB@PDA的平均尺寸約為104 nm，表明PDA涂層的平均厚度約為8 nm（圖1A-B）；AgNPs在PB@PDA表面上呈均勻分布（圖1C）。PB NPs的zeta電位隨著PDA的包裹而降低，AgNPs（Ag⁺）的加入導(dǎo)致PB@PDA的zeta電位從-17mV增加到-12mV（圖1D）。XRD表明：與PB@PDA相比，特征衍射峰存在于38.3°，對應(yīng)于金屬Ag的（111）面（圖1E）。拉曼光譜檢測顯示（圖1F）：PB NP的拉曼峰位于2154 cm^-1；PB@PDA和PB@PDA@Ag的拉曼峰在1402 cm^-1和1578 cm^-1處。XPS表明：由于PDA層的存在，PB@PDA和PB@PDA@Ag未觀察到明顯的Fe 2p峰（圖1G）。紫外可見吸收光譜檢測顯示（圖1H）：PB NPs在720 nm附近有強(qiáng)吸收峰；PB@PDA的吸光度峰移至710 nm；PB@PDA@Ag在440 nm附近有明顯吸收峰。FT-IR檢測顯示（圖1I）：PB NPs在2080 cm⁻¹有特征峰；加入PDA后，在約3420 cm⁻¹處出現(xiàn)了一個較寬較強(qiáng)的譜帶。以上結(jié)果表明PB@PDA@Ag的構(gòu)建成功。

2、PB@PDA@Ag具有較高的光熱轉(zhuǎn)換效率和優(yōu)異的光穩(wěn)定性

為了證明PB@PDA@Ag NPs作為PTT的光熱劑的能力，系統(tǒng)地比較了不同納米材料在NIR下的光熱效應(yīng)。結(jié)果表明：在808 nm NIR照射8 min后，PB、PB@PDA及PB@PDA@Ag的溫度升高分別為31.9℃、33.2℃和30.9℃，而純水的溫度僅升高1.7℃（圖2A）；實時光熱圖像直接顯示了它們的光熱效應(yīng)（圖2B）。PB@PDA@Ag具有激光密度依賴性和濃度依賴性的光熱轉(zhuǎn)換（圖2C-D）。PB@PDA@Ag的光熱轉(zhuǎn)換效率為30.35%（圖2E）。在1 W/cm²的激光照射5個循環(huán)后，PB@PDA@Ag吸收沒有降低，并維持恒定的光熱轉(zhuǎn)換效率，表現(xiàn)出較高的光穩(wěn)定性（圖2F）。因此，PB@PDA@Ag是一種很有前途的PTT試劑。

3、PB@PDA@Ag+NIR具有更強(qiáng)的體外抗菌活性

采用瓊脂擴(kuò)散法和NIR評價不同納米材料的抗菌能力。相對于其他實驗組，PB@PDA@Ag處理組所有受試菌的抑菌圈都清晰可見（圖3A）；金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸桿菌和AmprE的抑菌圈直徑分別約為14毫米、14毫米、16毫米和21毫米（圖3B）；表明PB@PDA@Ag對革蘭氏陰性菌E.coli和AmprE.coli的抑制作用更強(qiáng)（圖3C）。PB+NIR處理組MRSA和AmprE.coli存活率分別為33.0%和25.8%；PB@PDA@Ag處理組的存活率分別為33.3%和25.4%（圖3D-E）；PB@PDA@Ag+NIR處理組中，分別約99.77% MRSA和99.99% AmprE被殺死（圖3F-I）。

通過Calcein-AM/PI實驗分析不同處理組細(xì)菌的膜完整性。生理鹽水、NIR、PB和PB@PDA處理組中僅觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光；PB+NIR、PB@PDA+NIR和PB@PDA@Ag處理組同時觀察到綠色和紅色熒光；PB@PDA@Ag+NIR處理組觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光和極弱的綠色熒光（圖4A）。使用ImageJ軟件定量分析表明：與其他組相比，PB@PDA@Ag+NIR的抗菌功效最高（圖4B）。SEM圖像表明在用生理鹽水、NIR、PB或PB@PDA處理后，MRSA具有完整且光滑的表面；PB+NIR、PB@PDA+NIR或PB@PDA@Ag處理后，細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯的下垂和收縮（紅色箭頭所示）等破壞；而用PB@PDA@Ag+NIR處理后，細(xì)菌的結(jié)構(gòu)*被破壞（圖4C）。

4、PB@PDA@Ag的抗菌機(jī)理

監(jiān)測ROS水平，發(fā)現(xiàn)相較于其他處理組，PB@PDA@Ag+NIR處理組的ROS水平顯著上調(diào)（圖5A-B）。Ellman測定表明，PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR的GSH氧化水平分別高達(dá)45.8%和58.7%（圖5C）。檢測細(xì)菌內(nèi)ATP水平的變化發(fā)現(xiàn)：PB+NIR、PB@PDA+NIR、PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR處理組分別導(dǎo)致細(xì)菌ATP水平下降約47.8%、53.1%、77.8%和96.7%（圖5D）。這些結(jié)果表明：PB@PDA@Ag+NIR的抗菌作用是通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生、氧化GSH和降低ATP等途徑進(jìn)行的。同時，與對照組相比，PB@PDA@Ag+NIR處理的細(xì)菌蛋白質(zhì)滲漏增加了1.9倍（圖5E），表明PB@PDA@Ag+NIR對細(xì)菌細(xì)胞膜造成了嚴(yán)重破壞。

5、PB@PDA@Ag+NIR對MRSA生物膜損傷最大

持續(xù)性細(xì)菌感染與生物膜的形成密切相關(guān)，生物膜可以抑制抗生素的滲透，逃避宿主吞噬細(xì)胞的先天免疫攻擊。作者檢測了不同處理對MRSA形成的生物膜的影響（圖6A-C）：與對照組相比，單獨的NIR、PB和PB@PDA處理對MRSA生物膜的影響可以忽略不計；PB@PDA@Ag、PB+NIR和PB@PDA+NIR處理后，可以去除約51%~52%生物膜；PB@PDA@Ag+NIR處理后，可去除約76%生物膜。

6、PB@PDA@Ag+NIR對體內(nèi)傷口的愈合效果好

將MRSA感染傷口的雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為八組（圖7A），NIR照射5分鐘后，用PB、PB@PDA或PB@PDA@Ag處理的傷口區(qū)域的溫度增加到約53°C；PBS+NIR處理的傷口區(qū)域僅升高1.2°C（圖7B）。圖7C為在不同時間點進(jìn)行各種處理的傷口閉合的代表性照片。治療8天后，PBS、NIR、PB、PB+NIR、PB@PDA、PB@PDA+NIR、PB@PDA@Ag和PB@PDA@Ag+NIR組感染創(chuàng)面面積分別減少至58.79%、59.24%、56.81%、47.90%、51.46%、41.77%、41.88%和22.79%（圖7D）。此外，在所有組中均未觀察到體重的顯著波動（圖7E），表明這些測試的納米材料對小鼠具有良好的生物安全性。

通過H&E染色進(jìn)行炎癥分析，相較于其他實驗組，PB@PDA@Ag+NIR處理后，傷口上的炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著減少。此外，在PB@PDA@Ag+NIR組中可以清楚地觀察到完整的表皮層（由紅色箭頭表示）；對于其他組，不完整的表皮層伴有明顯的組織損傷（圖7F）。

7、PB@PDA@Ag+NIR有效促進(jìn)體內(nèi)MRSA感染的糖尿病傷口愈合

通過MKR轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠模擬臨床傷口模型，對MRSA感染的糖尿病傷口模型的體內(nèi)抗感染功效進(jìn)行評估（圖8A）。不同給藥方式處理后，在第12天，PB@PDA@Ag+NIR處理組的創(chuàng)面幾乎*愈合（圖8B-C）。與空白對照組相比，PB@PDA@Ag+NIR給藥組小鼠的體重變化可以忽略不計（圖8D），這證實了PB@PDA@Ag+NIR對小鼠的低毒性。通過比較感染區(qū)域的細(xì)菌CFU顯示，PB@PDA@Ag+NIR的殺菌效果最高（圖8E-F）。免疫熒光染色顯示，與其他組相比，PB@PDA@Ag+NIR處理組的感染創(chuàng)面VEGF表達(dá)水平最高（圖8G-H）。

綜上所述，我們推測PB@PDA@Ag+NIR促進(jìn)傷口慢性愈合的機(jī)制可能與以下原因有關(guān)：（1）PB@PDA@Ag光熱效應(yīng)產(chǎn)生局部熱療，釋放Ag⁺，消除感染創(chuàng)面大部分細(xì)菌；（2）PB@PDA@Ag+NIR給藥后可顯著降低創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)；（3）VEGF顯著上調(diào)可增加創(chuàng)面組織中新生血管的形成。在新生血管的幫助下，促進(jìn)參與創(chuàng)面愈合的細(xì)胞代謝和增殖，促進(jìn)再上皮化，實現(xiàn)創(chuàng)面高效愈合。

8、生物安全性評估

對血清進(jìn)行腎功能和肝功能分析，未發(fā)現(xiàn)PB@PDA@Ag對機(jī)體有任何毒性（圖9A-B）。H&E染色顯示：PB@PDA@Ag+NIR治療期間未對各器官的正常解剖結(jié)構(gòu)造成損傷或毒性（圖9C）。這些結(jié)果證明了PB@PDA@Ag可以有效、安全的*MDR細(xì)菌引起的慢性傷口感染。