研究背景
特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種進行性且最終致命的呼吸系統(tǒng)疾病，在全球范圍內影響超過500萬人。IPF是一種由肺泡上皮細胞（AEC）異常引發(fā)的疾病，異常活化的肺上皮細胞可以產生使成纖維細胞遷移、增殖和分化為活性肌成纖維細胞的介質。異常的成纖維細胞病灶分泌過量的細胞外基質（ECM），主要為膠原蛋白，導致肺組織纖維過度瘢痕化，肺泡結構破壞。因此，肺內ECM的局部清除和纖維化肺泡的上皮再生對于逆轉這種疾病的進展至關重要。然而，目前針對IPF的臨床藥物治療僅僅是減緩了疾病的進展和肺功能的惡化，卻無法恢復纖維化肺泡的功能，只能帶來一定的緩解。在某些情況下，一些藥物甚至會產生副作用。IPF的有效治療策略尚不明確，但刻不容緩。
基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類由多種蛋白水解酶組成的酶。其中，MMP13在ECM成分的降解中扮演重要角色。在纖維化肺組織中，盡管MMP13的表達增加，但由于肺內ECM的大量產生和膠原溶解不平衡，隨著IPF進展ECM沉積不斷增加，導致肺纖維化程度加重。在纖維化病灶中，增加MMP13可加速ECM降解，恢復肺泡空間。此外，IPF的*恢復還需要修復和再生受損的肺泡上皮細胞，以修復和重建完整的肺內氣體交換空間，維持正常的肺功能。肺泡上皮細胞的修復需要干細胞，即Ⅱ型肺泡上皮細胞（AEC2s）。在IPF的發(fā)病過程中，部分AEC2s會出現(xiàn)上皮-間質轉化、衰老、凋亡、甚至衰竭，角質細胞生長因子（KGF）是一種促進AEC2s有絲分裂的潛在因子，能誘導AEC2s增殖，抑制TGF-β1生成，提高表面活性蛋白分泌，有利于纖維化肺泡的上皮再生。因此作者推測MMP13和KGF聯(lián)合治療可加速肺內ECM的清除和重建被破壞的纖維化肺泡，從而逆轉IPF的進展，改善肺功能。
本研究開發(fā)了一種可吸入的納米遞送系統(tǒng)，共載基質金屬蛋白酶13 mRNA (mMMP13) 和角化細胞生長因子（KGF），傳遞到纖維化的肺組織中，從而逆轉博萊霉素誘導的小鼠模型的肺纖維化。魚精蛋白是一種陽離子核衍生蛋白，已被廣泛用于基因傳遞的研究中，然而，魚精蛋白與核酸之間的過度縮合反應，在一項癌癥疫苗研究中表現(xiàn)出有限的轉染效率。此外，由于其在人體內的異質性，存在交叉反應的潛在風險，限制了魚精蛋白在臨床中的應用。核糖體蛋白是一組與核糖體RNA（rRNAs）結合形成核糖體的內源性蛋白質，具有多種等電點（pIs）和分子量（MWs）的陽離子蛋白，可將異源交叉反應的風險降到 低，在生物醫(yī)學領域中應用前景更廣闊。此外，核糖體蛋白等電點的多樣性賦予了其正電荷的靈活性，核酸可以以仿生的方式濃縮成納米復合物。在本研究中，開發(fā)了一種具有不同理論等電點但分子量相近的多種核糖體蛋白。通過評估核糖體蛋白聚合的螢火蟲熒光素酶(mFluc) mRNA的體外轉染效率，篩選出最佳的核糖體重組蛋白用于遞送mMMP13。以核糖體蛋白聚合的mMMP13為核心、雙功能肽修飾的冠狀層和具有聚乙二醇化的KGF外保護層組裝成納米顆粒。當通過噴霧器吸入時，被微滴攜帶的納米制劑沉積在肺泡中，隨后滲透到間質纖維化灶，外層KGF在MMP2觸發(fā)后被原位釋放，RGD基序嫁接的核心暴露并特異性靶向于富含整合素的肌成纖維細胞和受損的AEC2s中，用于mMMP13的細胞內傳遞。在肺纖維化小鼠模型中，吸入式納米制劑治療加速了大量膠原蛋白的降解和肺泡上皮再生過程，進而協(xié)同恢復肺泡完整性，改善肺功能。
基本信息
摘要
特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種進行性的、最終可致命的呼吸系統(tǒng)疾病，可選擇的有效治療手段很少，由肺泡上皮細胞（AECs）的重復性微損傷引發(fā)，發(fā)展到細胞外基質（ECM）的大量沉積，最終導致纖維瘢痕化和肺泡結構的破壞。在本研究中，一種基于核糖體蛋白的mRNA吸入式納米制劑被用于清除肺內ECM并使被破壞的肺泡上皮再生，從而逆轉IPF中發(fā)生的纖維化灶。該納米制劑由核糖體蛋白聚合的mRNA為核心、雙功能肽修飾的冠狀層和具有聚乙二醇化KGF的外保護層依次組裝。當通過噴霧器吸入時，微滴攜帶的納米制劑沉積在肺泡中，并穿透纖維化灶，在基質金屬蛋白酶2（MMP2）被觸發(fā)后，外層KGFs被原位釋放，RGD基序嫁接的核心暴露，并特異性地靶向整合素升高的細胞，以便mRNA在細胞內傳遞。反復吸入納米制劑可通過增加MMP13的表達和促進KGFs介導的肺泡上皮再生，從而加速局部膠原蛋白的清除，協(xié)同改善博萊霉素誘導的小鼠模型的肺功能。本研究提供了一種可吸入的mRNA納米遞送系統(tǒng)，具有治療IPF的巨大潛力。
研究內容及結果
1.mMMP13遞送蛋白的篩選
首先開發(fā)了具有不同等電點的陽離子核糖體蛋白（RP），在不同的重量比（RP：mFluc=1、2、4、8、16）下制備核糖體蛋白聚合的mFluc核（mFluc@RP）。靶向整合素的冠狀層AA-PLL-PEG-c（RGDfK）是一種合成聚合物，具有pH響應型的電荷逆轉能力，可促進mRNA的內含體逃逸。AA-PLL-PEG-c（RGDfK）被定義為P。通過靜電相互作用制備了冠狀層包裹的mFluc@RP納米配合物（mFluc@RP/P）。通過測定mFluc@RP/Ps的形態(tài)學特征和轉染率，最終選取核糖體蛋白L32（RPL32）作為遞送mMMP13的最佳陽離子蛋白（圖1）。
圖1
接下來研究AA-PLL-PEG-peptide-PEG-N3（簡稱P-N3）和的mMMP13體外轉錄，優(yōu)化了RPL32聚合的mMMP13納米配合物（定義為mMMP13@RP）。該mRNA的封裝效率為91.4±0.030%。隨后，通過靜電吸引和鏈接反應制備吸入式mRNA納米制劑（定義為mMMP13@RP/P-KGF）。在透射電鏡（TEM）下，amMMP13@RP/P-KGF呈直徑約250nm的球形（圖2b），這與流體動力學直徑（261.6±2.558，251.2±5.093nm）一致（圖2c）。在TEM圖像中觀察到pH7.4或pH5.5 MMP2預處理的amMMP13@RP/P-KGF的形態(tài)學變化（圖2b），在pH7.4條件下，與MMP2孵育后，納米制劑的外殼部分破壞，大部分球形納米顆粒變成不規(guī)則形狀。當pH值為5.5時，納米顆粒周圍出現(xiàn)明顯松散的冠狀層，說明在酸性條件下發(fā)生了電荷逆效應。此外，從mMMP13@RP（172.7±3.900nm）到mMMP13@RP/P/P-N3（228.3±3.265nm）和mMMP13@RP/P-KGF（261.6±2.558nm），粒徑逐漸增大，粒子Zeta電位明顯改變（圖2c，d）。這表明P-N3和KGF的嫁接有效。為了進一步證實，用ELISA法測定了KGF的封裝效率，發(fā)現(xiàn)約41.85%的KGF被嫁接到mMMP13@RP/P-KGF的表面。此外，測定了MMP2對amMMP13@RP/P-KGF的反應性，并通過ELISA法監(jiān)測KGF的釋放情況。在50×10?9 M MMP2孵育6h后，amMMP13@RP/P-KGF釋放出超過50.1%的KGF，比無MMP2孵育組高21倍。在50×10?9 M MMP2孵育24h后，約67.2%的KGF被釋放，證實了amMMP13@RP/P-KGF對MMP2的高敏感性（圖2e）。amMMP13@RP/P-KGF的MMP2應答能力證實了KGF在纖維化灶中的特異性釋放，從而在理論上減少了副作用。
圖2
2.吸入式納米制劑在胞內傳遞和胞質釋放的表現(xiàn)
纖維化肺泡高度表達MMP2，可以有效引導KGF從納米制劑中釋放。作者比較了MMP2處理前后納米制劑的細胞毒性（圖3a），沒有檢測到被納米制劑處理或者MMP2預處理的的體外AECs有任何顯著的細胞毒性作用。隨后，評估了mMMP13@RP/P-KGF促進肺泡上皮再生的能力，在圖3b中，MMP2預處理的amMMP13@RP/P-KGF顯著促進了AEC2s的增殖，表明mMMP13@RP/P-KGF在體內促進上皮再生方面有較大的潛力，進一步分析了mMMP13的體外細胞內的遞送情況，通過TGF-β1刺激成纖維細胞誘導所得肌成纖維細胞的表型，用于后續(xù)分析，在IPF的細胞環(huán)境下，異常激活的肌成纖維細胞和受損的AEC2s（以A549細胞為代表），其整合素表達水平升高，在纖維化病灶中很明顯，因此對IPF的進展至關重要。MMP2預處理的amMMP13@RP/P-KGF納米制劑分別與成纖維細胞、肌成纖維細胞、AEC2s和A549細胞孵育6h，以驗證在纖維化肺泡中，肌成纖維細胞和受損的AEC2s是否大量吸收納米制劑，為了觀察細胞攝取和胞內運輸，mMMP13被紅色熒光探針（Cy5）標記，并封裝在納米制劑中，結果顯示肌成纖維細胞和A549細胞的胞質熒光信號強于成纖維細胞或AEC2細胞，這一結果表明了細胞整合素和RGD環(huán)肽之間的相互作用。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）顯示，經MMP2預處理的amMMP13@RP/P-KGF處理肌成纖維細胞和A549細胞的紅色熒光強度在6小時強于1或3小時（圖3c），與未經MMP2預處理的amMMP13@RP/P-KGF孵育的細胞相比，經MMP2預處理的amMMP13@RP/P-KGF孵育的細胞熒光信號顯著增強（圖3d，h）。流式細胞術的結果進一步證實了這些發(fā)現(xiàn)（FCM；圖3e、f、i、j）。此外，還研究了該納米制劑的內含體逃逸過程，在amMMP13@RP/P-KGF（經MMP2預處理）處理的肌成纖維細胞中，隨著孵育時間的延長，溶酶體（lysosome）綠色熒光與Cy5紅色熒光的重疊逐漸減少，表明納米制劑從內含體中成功逃逸（圖3k）。吸入式納米制劑在mRNA胞內傳遞和胞質釋放顯示出了生物醫(yī)學應用的潛力。
圖3
3.體外轉染效率評價
為了在體外觀察轉染結果，本研究使用增強型綠色熒光蛋白mRNA（mEGFP）作為模型mRNA來構建類似的納米制劑。研究了該納米制劑保護mRNA免受核糖核酸酶降解的能力，經核糖核酸酶處理的amEGFP@RP/P-KGF組的轉染效率與未經核糖核酸酶處理的amEGFP@RP/P-KGF對照組的轉染效率相當，表明在核糖核酸酶存在下，納米制劑可以保護mRNA。用脂質體3000（lipo3000）作為標準轉染試劑，形成lipo3000聚合的mEGFP納米制劑，并與RPL32聚合的mEGFP納米制劑進行比較，在RPL32聚合的mEGFP納米制劑組中，可以觀察到更高的轉染效率。此外，如圖4a-d所示，在肌成纖維細胞或A549細胞中，MMP2預處理的amEGFP@RP/P-KGF組與amEGFP@RP/P-KGF組的熒光密度和GFP陽性率存在顯著差異，進一步驗證了MMP2對mMMP13@RP/P-KGF的響應特性。通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中的MMP13，評估其體外表達情況（圖4e）。結果表明，與對照組相比，MMP13蛋白水平在24h后仍保持強烈上調（肌成纖維細胞增加了39倍，A549細胞增加了45倍）。
圖4
4.mMMP13@RP/P-KGF的體內抗纖維化性能
在博萊霉素誘導的IPF小鼠模型中，探索了mMMP13@RP/P-KGF的生物分布。mFluc、mFluc@RP/P和mFluc@RP/P-KGF均被吸入，給藥濃度為0.5mg/mL。生物發(fā)光成像顯示，在mFluc@RP/P和mFluc@RP/P-KGF處理的小鼠中出現(xiàn)了生物發(fā)光信號。值得注意的是，沒有明顯的信號定位于其他器官（心臟、肝、脾和腎），這表明吸入的納米制劑生物分布效果很好。通過WB分析一次吸入mMMP13@RP/P-KGF后MMP13在體內的表達情況，作為確定給藥間隔時間的參考。此外，通過蘇木精和H&E染色評估納米制劑的潛在毒性，染色切片中未見明顯的組織病理學異常。這些結果表明，本研究開發(fā)的給藥系統(tǒng)具有良好的肺滯留能力和生物相容性。隨后，詳細研究了博萊霉素誘導的IPF小鼠模型的治療效果，如圖5a所示，給予博萊霉素后10天，小鼠隨機分為6組（n=6），給予PBS、mMMP13@RP/P、mEGFP@RP/P-KGF、mMMP13@RP/P-KGF、吡非尼酮和mMMP13@RP/P-KGF、吡非尼酮處理，每3天給藥5次，mRNA劑量為750µg/kg，未給予博萊霉素誘導組（n=6）以PBS處理作為對照，灌注博萊霉素25d后處死所有小鼠，收集肺組織進行組織學分析，用具有代表性的H&E染色法顯示肺泡結構的完整性，Masson和天狼猩紅染色法顯示膠原蛋白沉積的程度，平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的免疫組化染色法反映肌成纖維細胞活性（圖5b）。與PBS處理組相比，吸入mMMP13@RP/P和mEGFP@RP/P-KGF在治療期后緩解了IPF，而吸入mMMP13@RP/P-KGF對纖維化消退的影響更顯著。吡非尼酮是一種臨床批準用于治療IPF的藥物，其可以減少多種促纖維化因子的表達，防止膠原和炎癥細胞在肺組織中的積累，與吸入mMMP13@RP/P-KGF在胃內聯(lián)合給藥（圖中的G7處理）。在恢復肺泡上皮結構和減少膠原沉積方面，與單獨給2種藥相比，聯(lián)合治療顯示出更顯著的療效。通過WB法測定α-SMA的蛋白水平（圖5c），分析α-SMA/β-actin比值（圖5d），結果表明，在mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮聯(lián)合給藥組中，其蛋白水平顯著低于PBS處理組。Ashcroft評分和羥脯氨酸含量的進一步研究證實了這些結果（圖5e，f）。為了驗證MMP13在體內的表達，讓IPF小鼠吸入不同的納米制劑（圖5g），WB檢測表明mMMP13@RP/P或mMMP13@RP/P-KGF處理組中MMP13的表達水平高于對照組或mEGFP@RP/P-KGF處理組（圖5h，i），說明了mMMP13在體內的高效傳遞。此外，利用免疫熒光染色法檢測MMP13和α-SMA在治療小鼠肺組織中的共定位，結果顯示，與MMP13蛋白對應的紅色熒光廣泛分布于mMMP13@RP/P處理小鼠的肺組織切片中，相比之下，在mMMP13@RP/P-KGF處理組中，紅色熒光主要出現(xiàn)在纖維化灶中（圖5g）。另外與PBS處理組相比，mMMP13@RP/P-KGF處理組小鼠的體重顯著增加。
圖5
圖注：G1：生理鹽水+PBS；G2：博萊霉素+PBS；G3：博萊霉素+mMMP13@RP/P；G4：博萊霉素+mEGFP@RP/P-KGF；G5：博萊霉素+mMMP13@RP/P-KGF；G6：博萊霉素+吡非尼酮；G7：博萊霉素+mMMP13@RP/P-KGF+吡非尼酮
5.納米制劑對肺泡修復和肺功能的影響
基于對博萊霉素誘導的小鼠模型的整體纖維化水平的分析，進一步研究了納米制劑對肺泡修復和肺功能的影響。在IPF中易感的肺泡上皮主要由介導氣體交換的AEC1s和分泌表面活性物質的AEC2s和祖細胞組成。作者進一步研究了博萊霉素損傷后不同處理組AEC1和AEC2分布的變化，以評估肺泡損傷和修復。水通道蛋白5（AQP5，AEC1標記物）和表面活性蛋白C（SP-C，AEC2標記物）的免疫染色顯示，mMMP13@RP/P-KGF處理組和mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮共同給藥組的AQP5和SP-C明顯升高，結果表明吸入mMMP13@RP/P-KGF可促進肺泡修復（圖6a-c）。這些結果通過WB得到證實（圖6d?f）。隨后，在治療期結束時進行多次肺功能測試，以監(jiān)測隨機分組小鼠（n=6）的肺功能變化。結果與肺泡改善效果一致，總肺活量（TLC）、用力肺活量（FVC）、功能殘氣量（FRC）、最大呼氣流量（PEF）、50ms用力呼氣容積（FEV50）、肺阻力（RL）、肺動態(tài)順應性（Cdyn） 接近正常水平，mMMP13@RP/P-KGF處理組和mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮共同給藥組比PBS處理組更明顯（圖6g-m）。Kaplan-Meier生存曲線（圖6n）顯示，與PBS處理組相比，mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮聯(lián)合處理顯著延長了博萊霉素誘導的小鼠模型的生存時間?？偟膩碚f，吸入式mMMP13@RP/P-KGF納米制劑顯著加速了博萊霉素誘導小鼠的受損肺泡上皮再生，并改善了肺功能。
圖6
研究結論
本研究開發(fā)了一種基于核糖體蛋白可吸入的mRNA納米制劑，該制劑能夠降解博萊霉素誘導的IPF小鼠模型中的肺內ECM，使肺泡上皮再生。篩選了最佳的核糖體蛋白來組裝蛋白聚合的mRNA核心，以高效傳遞mMMP13。在該納米制劑中使用的雙功能肽顯著提高了靶向性和細胞攝取效率。外層的KGF在纖維化灶中響應性釋放，以促進上皮再生，這有助于肺泡重建。體內實驗表明，吸入式納米制劑對緩解IPF有顯著的療效，并表現(xiàn)出 的生物相容性。該工作不僅提供了一種新的mRNA可吸入式遞送策略，也為嚴重IPF的患者提供了一種具有巨大潛力的可替代性療法。
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