組織切片的特殊染色結(jié)果圖可以顯示組織中的特定物質(zhì)或結(jié)構(gòu),通常使用拍照或目測(cè)的形式進(jìn)行對(duì)比和判別,但是想要更直觀的分析比較或者讓結(jié)果在文章里更有說(shuō)服力就需要對(duì)染色結(jié)果圖進(jìn)行定量或半定量的取值分析。目前SCI高分文章常用的兩種對(duì)特殊染色結(jié)果圖進(jìn)行定量分析的方法如下:
1
利用一定量特定溶劑洗脫與目標(biāo)物質(zhì)或結(jié)構(gòu)結(jié)合的染料,之后測(cè)定洗脫液在特定波長(zhǎng)下的吸光度,最后基于染料標(biāo)曲對(duì)切片中的特定物質(zhì)或結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。
2
利用圖像處理軟件(如Image J或IPP)進(jìn)行處理,提取陽(yáng)性區(qū)域像素面積或灰度,進(jìn)而半定量計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域占總面積的百分比,或者計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域的平均灰度值或光密度值。
通過(guò)洗脫進(jìn)行半定量分析方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于找到一種特異性洗脫陽(yáng)性染料而不洗脫其他染料的洗脫劑,索萊寶的染色試劑盒可用于洗脫陽(yáng)性染料后半定量分析的產(chǎn)品包括鈣鹽的茜素紅染色、酸性糖蛋白的阿利新藍(lán)染色、中性脂質(zhì)的油紅O染色和膠原蛋白天狼星紅染色等等。洗脫測(cè)定法對(duì)樣本大小,染色狀態(tài)和洗脫體積要求較高,通常只用于細(xì)胞樣本的結(jié)果進(jìn)行定量分析。
茜素紅染色(G1452/G3280/G3281):茜素紅常用來(lái)指示骨組織或者骨細(xì)胞中的鈣鹽,標(biāo)記為紅色,洗脫時(shí)需要用到10%的十六烷基吡啶(C9890)溶液。以骨細(xì)胞為例,細(xì)胞應(yīng)按照適宜的濃度在96孔板中培養(yǎng),按照正常程序染色骨細(xì)胞中的鈣鹽,染色之后用蒸餾水沖洗干凈,將蒸餾水甩干后加入洗脫液孵育足夠的時(shí)間使結(jié)合在細(xì)胞上的茜素紅充分洗脫,最后檢測(cè)洗脫溶液的吸光度值,茜素紅的檢測(cè)波長(zhǎng)為562nm。
油紅O染色(G1260/G1261):油紅O染色常用來(lái)指示各種組織中的脂肪堆積,與傳統(tǒng)的蘇丹染料相比,油紅O可以顯示組織中更微小的脂滴并將脂滴染色為紅色,油紅O洗脫常用的溶劑為100%異丙醇。培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞或者是有脂肪沉積的組織按照說(shuō)明書(shū)的步驟染色后,用60%異丙醇稍洗去除非陽(yáng)性著色,用100%異丙醇洗掉陽(yáng)性油紅O染料,在490nm處測(cè)定吸光度值對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行取值分析。
其他具有類(lèi)似性質(zhì)的染色方法也可以通過(guò)查閱資料找到合適的洗脫溶劑、洗脫時(shí)間和檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行取值分析,具體流程可參考茜素紅和油紅O染色。
圖像處理法要比吸光光度法對(duì)實(shí)驗(yàn)要求更低,適用的范圍更廣(包括細(xì)胞結(jié)果和切片結(jié)果,常規(guī)染色、特殊染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光均可應(yīng)用),但是對(duì)成像的要求更高,要求取景定位和成像條件盡量一致。對(duì)于批量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理更便捷。
圖像處理軟件量化陽(yáng)性區(qū)域面積或者光密度值的方法如下:
(1)在Image J或IPP軟件中打開(kāi)需要量化的圖片
(2)染色結(jié)果選擇Image—Type—RGB Stack(操作完成之后下方滾動(dòng)條可以選擇特定顏色)
(3)閾值調(diào)整,手動(dòng)選擇出所需的色彩范圍
(4)讀取灰度值或?qū)⒒叶戎缔D(zhuǎn)換為光密度值
(5)選擇檢測(cè)內(nèi)容,一般應(yīng)選擇面積、灰度值(此時(shí)可轉(zhuǎn)換為光密度值)、陽(yáng)性面積百分比和檢測(cè)選中區(qū)域等選項(xiàng)(其中光密度值/面積即為平均光密度值)
(6)數(shù)值檢出(可以選擇整張圖片檢出,也可以選擇圖片上特定區(qū)域檢出,檢出的數(shù)值導(dǎo)出到excel之后即可用于分析作圖)
為了獲得可靠的結(jié)果,各組之間應(yīng)該控制相同的染色時(shí)間,拍照視野盡量選取相近的區(qū)域,分析結(jié)果時(shí)也應(yīng)該設(shè)置相同的閾值,可以使用Image J的批處理功能快速計(jì)算結(jié)果。
關(guān)于更多特殊染色試劑盒與結(jié)果分析的方法,請(qǐng)登錄索萊寶查詢(xún)
參考文獻(xiàn)
1. Li M, Du M, Wang Y, Zhu J, Pan J, Cao Z, He H. CircRNA Lrp6 promotes cementoblast differentiation via miR-145a-5p/Zeb2 axis. J Periodontal Res. 2021 Dec;56(6):1200-1212.(doi: 10.1111/jre.12933)
2. Li Y, He C, Ran L, Wang Y, Xiong Y, Wang Y, Zhu J, Lin Y. miR-130b duplex (miR-130b-3p/miR-130b-5p) negatively regulates goat intramuscular preadipocyte lipid droplets accumulation by inhibiting Krüppel-like factor 3 expression. J Anim Sci. 2023 Jan 3;101:skad184. (doi: 10.1093/jas/skad184)
3. Lin H, Li X, Zhao J, Wang L, Liu Y, Gao C. D-mannose reduces adipogenesis by inhibiting the PI3K/AKT signaling pathway. Histol Histopathol. 2023 May 23:18631. (doi: 10.14670/HH-18-631)
4. Zhang M, Lin J, Zhang J, Zhao R, Wan J, Nong Y. Artesunate inhibits airway remodeling in asthma via the MAPK signaling pathway. Front Pharmacol. 2023 Mar 14;14:1145188.(doi: 10.3389/fphar.2023.1145188)
版權(quán)所有 ICP備案號(hào): 管理登陸 技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng) 總流量:780002 網(wǎng)站地圖