R8280 
rR8280 rProteinA/G Beads rProtein A/G 瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)

rProtein A/G Beads 是將rProteinA/G 高密度定向偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠微球表面，該產(chǎn)品
具有更高的抗體結(jié)合能力和較低的蛋白非特異吸附率，洗脫條件更均一，一步純化即可從血
清樣品中分離出純度大于90%的抗體。

++++=結(jié)合能力強(qiáng)；++=結(jié)合能力中等；—=結(jié)合能力弱或沒(méi)有結(jié)合

純化流程：
本產(chǎn)品分為兩種應(yīng)用：抗體純化流程和免疫沉淀流程，免疫沉淀流程還分為直接法和間
接法。下面操作就從這三個(gè)方面詳細(xì)介紹。
1、Buffer 的準(zhǔn)備
所用水和Buffer在使用之前建議用0.22μm或0.45 μm濾膜過(guò)濾。
結(jié)合/ 洗雜Buffer： 0.15MNaCl，20 mMNa2HPO4，pH7.0
洗脫Buffer： 0.1M甘氨酸，pH3.0
中和液： 1MTris-HCl，pH8.5
交聯(lián)Buffer： 0.2M三乙醇胺，pH8.2
終止液： 50 mMTris，pH7.5
2、樣品準(zhǔn)備
上柱之前要確保樣品溶液有合適的離子強(qiáng)度和pH 值，可以用結(jié)合/洗雜緩沖液對(duì)血清樣品、腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，或者樣品用結(jié)合/洗雜緩沖液透析。
樣品在上樣前建議離心或用 0.22μm或 0.45μm 濾膜過(guò)濾，減少雜質(zhì)，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。
3、抗體純化流程操作方法
抗體純化流程示意圖如:

1)將 rProtein A/G Beads 裝入合適的層析柱，層析用 5 倍柱體積的結(jié)合Buffer 進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。
2)將樣品加到平衡好的 rProtein A/G Beads 中（保證目的蛋白與 rProtein A Beads 充分接觸，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。
3)用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。
4)使用5-10倍柱體積的洗脫Buffer，收集洗脫液，即目的蛋白組分。
5)依次使用3倍柱體積的結(jié)合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料，后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡，然后保存在等體積的20%的乙醇中，置于4 度保存，防止填料被細(xì)菌污染。
6)SDS-PAGE檢測(cè)將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE 檢測(cè)純化效果。
4、 免疫沉淀直接法操作流程
免疫沉淀直接法操作流程示意圖如下：4.1 抗體吸附
1）取適量的 rProtein A/G Beads 加入到2ml離心管中，500轉(zhuǎn)離心1min，吸棄上清。
2)加入0.5ml結(jié)合Buffer，懸浮填料（使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)
蛋白的作用），500 轉(zhuǎn)離心1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。
3)向步驟2)平衡的填料中加入抗體溶液，懸浮填料，室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕
翻轉(zhuǎn)離心管，約30min 后，500 轉(zhuǎn)離心1min，收集上清液，留待檢測(cè)。
4)向3)的填料中加入0.5ml的洗雜Buffer，懸浮填料，進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，500 轉(zhuǎn)離心1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。
4.2 抗體交聯(lián) (備選)
如果需要將抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物共同洗脫，請(qǐng)忽略本步驟，直接進(jìn)行4.3。
1) 向清洗過(guò)的填料中加入1ml 交聯(lián)Buffer，500 轉(zhuǎn)離心1min，吸棄上清。
2) 再向其中加入1ml20 mMDMP（dimetylpimelimidatedihydrochloride）的交聯(lián)Buffer，此試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配，懸浮填料，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，促使Buffer 和填料充分接觸，約30min 后，500 轉(zhuǎn)離心1min，吸棄上清。
3) 再向其中加入1ml 終止液，懸浮填料，終止交聯(lián)反應(yīng)，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，約15min 后，500 轉(zhuǎn)離心1min，再吸棄上清。
4)加入0.5ml的洗雜Buffer，懸浮填料，進(jìn)行清洗，500轉(zhuǎn)離心1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。
4.3 抗原沉淀反應(yīng)
1)抗原吸附：加入含有抗原的樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與填料-抗體復(fù)合物均勻分散。
在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管10min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng)1h 或者在4℃下反應(yīng)過(guò)ye。
2)洗雜：將上述完成抗原吸附的填料-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行離心，500 轉(zhuǎn)離心 1min，收集上清液，置于冰上以備后續(xù)檢測(cè)。向離心管中加入 1ml洗雜 Buffer，用移液器輕輕吹打使填料-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行離心分離，500 轉(zhuǎn)離心1min，棄上清液。再重復(fù)洗滌兩次。后加入 1ml洗雜液，用移液器將填料-抗體-抗原復(fù)合物懸液轉(zhuǎn)移新的1.5 ml離心管中，并進(jìn)行離心分離，500轉(zhuǎn)離心1min，棄上清液。
3)抗原洗脫：提供以下兩種抗原洗脫方案，可根據(jù)后期檢測(cè)的需要選擇不同的抗原洗脫方法。
變性洗脫法： 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE 檢測(cè)。向離心管中加入25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均勻，95℃加熱5min。然后進(jìn)行離心，500轉(zhuǎn)離心1min，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。
非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向離心管中加入5 倍柱體積的洗脫Buffer，用移液器吹打5 次，混勻，然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，10min 后，離心，500 轉(zhuǎn)離心1min，吸取上清液，收集洗脫組分，即為目標(biāo)抗原，收集上清液新的離心管中，并立即加入十分之一體積的中和液，將洗脫組分pH 調(diào)節(jié)7.0-8.0，用于后期功能分析。
5 免疫沉淀間接法操作流程
免疫沉淀間接法操作流程示意圖如下：

1)抗體與抗原混合：將抗體與含有目的蛋白的裂解液混合，室溫震蕩孵育30min-60min，或者2-8 度孵育過(guò)ye，取決于抗體與抗原的結(jié)合效率以及抗原的穩(wěn)定性，需要自己優(yōu)化結(jié)合條
件。形成抗原-抗體混合物。
注意：抗體的加入量要考慮到下面填料的量，抗體的加入量過(guò)多會(huì)影響到抗原-抗體混
合物與填料的結(jié)合。建議抗體加入量為填料80%的大載量。
2)填料準(zhǔn)備：取適量的 rProtein A/G Beads 加入到2ml離心管中，500 轉(zhuǎn)離心 1min，吸棄
上清。加入0.5ml 結(jié)合Buffer，懸浮填料（使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到
保護(hù)蛋白的作用），500 轉(zhuǎn)離心1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。
3)抗原-抗體混合物的吸附：將步驟2.5.1中得到的抗原-抗體混合物加入到處理好的填料中，
均勻，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，促使樣品和填料充分接觸并吸
附，約30min 后，約30min 后，500 轉(zhuǎn)離心1min，收集上清液，留待檢測(cè)。
4)洗雜：向上述離心管中加入0.5ml的洗雜Buffer，懸浮填料，進(jìn)行清洗，去除非特異性吸
附的雜蛋白，500 轉(zhuǎn)離心1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。
5)抗原洗脫：提供以下兩種抗原洗脫方案，可根據(jù)后期檢測(cè)的需要選擇不同的抗原洗脫方
法。
變性洗脫法： 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE 檢測(cè)。向離心管中加入
25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均勻，95℃加熱5min。然后進(jìn)行離心，200轉(zhuǎn)離心
1min，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。
非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向離心
管中加入5 倍柱體積的洗脫Buffer，用移液器吹打5 次，混勻，然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混
合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，10min 后，離心，500 轉(zhuǎn)離心1min，吸取上清液，收集洗脫
組分，即為目標(biāo)抗原，收集上清液新的離心管中，并立即加入十分之一體積的中和液，將
洗脫組分pH 調(diào)節(jié)7.0-8.0，用于后期功能分析。
填料清洗
rProtein A/G Beads 可以重復(fù)使用而無(wú)需再生，但隨著一些變性物質(zhì)的沉淀和蛋白的聚
集，往往造成流速和結(jié)合載量都下降，嚴(yán)重影響柱子的性能，這時(shí)需要對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行清洗。
去除一些沉淀或變性物質(zhì) 用2 倍柱體積的6M 鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗，然后立即用5 倍柱體
積的PBS,pH7.4清洗。去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì) 用3-4倍柱體積的
70%乙醇或2倍柱體積的1% TritonX-100清洗，然后然后立即用5倍柱體積的PBS,pH7.4
清洗。