魚(yú)全血中性粒細(xì)胞分離液試劑盒   
貨號(hào)：P4190
規(guī)格：2×200ml/KIT
保存：室溫避光儲(chǔ)存，有效期少 2 年。

產(chǎn)品組成：
                   名稱(chēng)              規(guī)格
                   試劑 A            200ml
                   紅細(xì)胞裂解液      100ml
                   全血及組織稀釋液  200ml
                   細(xì)胞洗滌液        200ml
 

注意事項(xiàng)：
     A．本實(shí)驗(yàn)要求，在正常大氣壓下，分離液、分離樣本以及分離環(huán)境溫度為20℃±2℃。分離液在低溫時(shí)呈較高密度，在高溫時(shí)呈較低密度。細(xì)胞分離液從冰箱取出后，不可立即使用，操作前可將樣本和分離液復(fù)溫18-22℃。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，好在取血后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液提取后存放時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞活性越低。
    B．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如需稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含Ca 2+ 、Mg 2+ 離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞凝集，大大降低細(xì)胞得率及純度。
    C．優(yōu)抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。注意在血液稀釋過(guò)程中去除抗凝劑體積。
    D．好使用無(wú)靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過(guò)堿處理的玻璃離心管。
    E．由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國(guó)內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶(hù)可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間，摸索的分離條件（具體分離條件各實(shí)驗(yàn)室自定）。
 

分離方法 ：
    1. 取1ml新鮮抗凝血，與全血及組織稀釋液1:1 混勻后小心加于1份A液之液面上；
    2. 以500g（約1800轉(zhuǎn)/分）離心25分鐘(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子)。
    3. 此時(shí)離心管中由上下細(xì)胞分四層。*層：為血漿層。第二層：為環(huán)狀乳白色的單個(gè)核細(xì)胞層。
    第三層：為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細(xì)胞）。第四層：為紅細(xì)胞層。棄去*層血漿層及第二層細(xì)胞，收集第三層分離液層和第四層紅細(xì)胞層，放入含細(xì)胞洗滌液10ml的試管中，充分混勻后，以500g約（1800轉(zhuǎn)/分）離心30分鐘。沉淀經(jīng)1次洗滌后用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，再經(jīng)3次洗滌去除紅細(xì)胞內(nèi)溶物和碎片后取沉淀細(xì)胞即為所需中性粒細(xì)胞。
    注：A. 提取率約為80%。
    B. 紅細(xì)胞裂解過(guò)程詳見(jiàn)“紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明”。

紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明 ：
    本公司紅細(xì)胞裂解液在裂解紅細(xì)胞的同時(shí)不損傷并在一定程度上保護(hù)淋巴細(xì)胞(lymphocyte)或其它有細(xì)胞核的細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。另外，本裂解液中無(wú)DNA及RNA酶，配合細(xì)胞分離液使用所提細(xì)胞可廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
    紅細(xì)胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱(chēng)ACK Lysis Buffer，是一種用于從人或鼠等的血液或組織細(xì)胞樣品中裂解并去除無(wú)細(xì)胞核紅細(xì)胞的溶液。
    本裂解液不適用于有細(xì)胞核紅細(xì)胞的裂解，例如鳥(niǎo)或禽類(lèi)的紅細(xì)胞。本裂解液經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理，處理過(guò)的血液或組織細(xì)胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合以及核酸或蛋白的提取及各種常規(guī)的分析和檢測(cè)。

使用說(shuō)明：
    A.  對(duì)于組織細(xì)胞樣品：
    a. 新鮮組織經(jīng)過(guò)膠原酶或胰酶等消化處理，通過(guò)適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。
    b. 加入3-5倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體積為1ml，則加入3-5ml的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。
    c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
    d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。
    e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)少為細(xì)胞沉淀體積的5倍。4℃離心效果更佳。
    f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
    B.  對(duì)于組織細(xì)胞樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟：
    a. 新鮮組織經(jīng)過(guò)膠原酶或胰酶等消化處理，通過(guò)適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。
    b. 對(duì)于0.2ml細(xì)胞沉淀加入1ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫或4度操作均可。
    c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，混勻。
    d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
    e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。
    f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過(guò)程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時(shí)不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí)需要大體積的離心管。
    C.  對(duì)于血液樣品：
    a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。
    b. 加入6-10倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體積為1ml，則加入6-10ml的紅細(xì)胞裂解液。 本步驟在室溫或4度操作均可。 注意： 對(duì)于鼠的血液， 裂解1-2分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長(zhǎng)裂解時(shí)間4-5分鐘，并且裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。
   c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
   d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。
   e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)少為細(xì)胞沉淀體積的5倍。4℃離心效果更佳。
   f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
注：對(duì)于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進(jìn)行離心棄上清的操作，直接在第二步中加入10倍血液體積的紅細(xì)胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對(duì)于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長(zhǎng)裂解時(shí)間10分鐘，但通常不宜超過(guò)15分鐘，并且裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。后續(xù)步驟相同。
   D.  對(duì)于血液樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟：
   a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對(duì)于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長(zhǎng)裂解時(shí)間10分鐘，但通常不宜超過(guò)15分鐘，并且裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。
   b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，混勻。
   c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
   d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。
   e. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
      注：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過(guò)程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時(shí)不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí)需要大體積的離心管。

產(chǎn)品性能指標(biāo) ：

pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內(nèi)毒素 ≤0.5EU/ml
無(wú)菌 直接接種培養(yǎng)14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每50ml 溶液中含10µm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25µm 以上的不溶性微粒5 粒以下

貯藏及保存期限 ：
    本分離液是敏光型的，應(yīng)在18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置4℃保存，有效期一周，若保證無(wú)微生物污染，啟封后可置4℃長(zhǎng)期保存。未啟封前保存溫度較低（10℃以下）時(shí)分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

魚(yú)全血中性粒細(xì)胞分離液試劑盒

參考文獻(xiàn)：
《A novel detection method of Cryptosporidium parvum infection in cattle based on Cryptosporidium parvum virus 1》 作者:Lixin Tai,  Jianhua Li,  Jigang Yin,  Nan Zhang,  Ju Yang , He Li, Zhengtao Yang,  Pengtao Gong,  Xichen Zhang 期刊:Acta Biochimica et Biophysica Sinica 影響因子:1.807 PMID:30544221