核蛋白抽提試劑盒 對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞: 1.根據(jù)用量取適當(dāng)?shù)臐{蛋白抽提試劑和核蛋白抽提試劑加入 PMSF,使 PMSF 的終濃度為 1mM。PMSF 需現(xiàn)用現(xiàn)加,若目標(biāo)蛋白含有豐富的半胱氨酸,可以在兩種蛋白抽提液中加入 DTT 終濃度 0.5mM。 2.對(duì)于貼壁細(xì)胞,去除培養(yǎng)液,用 PBS 洗一遍,用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞,或用 EDTA 消化后吹打下細(xì)胞(好不用胰酶硝化,以免過度消化蛋白)。500 g 離心 2~3 分鐘收集細(xì)胞,吸盡上清留下沉淀備用。 3.對(duì)于懸浮細(xì)胞:用 PBS 洗一遍,500 g 離心 2~3 分鐘收集細(xì)胞,吸盡上清,留下細(xì)胞沉淀備用。 4.按照每 20ul 細(xì)胞沉淀加入 200ul 漿蛋白抽提試劑的比例加入裂解液。 5.高速劇烈渦旋 15 秒,使細(xì)胞*分散開。若沉淀沒有*分散,可以適當(dāng)延長(zhǎng)渦旋時(shí)間。 6.500 g 離心 2~3 分鐘,去上清。 7.加入漿蛋白抽提試劑 200ul,高速劇烈渦旋 5 秒,冰浴 10 分鐘。 8.高速劇烈渦旋 5 秒,4℃12000~16000g 離心 10 分鐘。 9.上清即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白??蛇M(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western,但蛋白濃度很低,可能需要濃縮。 10.*吸盡殘余的上清,避免細(xì)胞漿蛋白污染,加入 100ul 核蛋白抽提試劑。 11.高速渦旋 15 秒或用移液器吹打*分散,放回冰浴中 5 分鐘,4℃12000~16000g 離心 10 分鐘。 12.立即吸取上清預(yù)冷的樣品管中,此即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白??蛇M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-70℃凍存。 對(duì)于組織樣品: 把組織稱重后,盡可能切成非常細(xì)小的碎片,按每 50mg 組織加入 200ul-500ul PBS,用勻漿器冰上勻漿勻漿制成細(xì)胞懸液,500 g 離心 2~3 分鐘收集細(xì)胞,吸盡上清,收集沉淀。加入 200ul 漿蛋白抽提試劑后接上述步驟 5 |